[发明专利]一种婴幼儿排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的分析方法

说明书

本发明涉及一种婴幼儿排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的分析方法。其特征是：样品经过水溶均质提取，加入有机溶剂沉淀除去蛋白后，再经在线的净化柱除去色素、乳糖及其他中心糖的干扰，获得的酸性糖及酸性糖衍生物经亲水作用色谱分离，液相或质谱检测，得到婴幼儿排泄物酸性糖及酸性糖衍生物的组成和含量信息。该方法具有定量准确，重现性好，操作稳定可控，分析通量高等特点，适用于婴幼儿排泄物的快速、高通量分析。

技术领域

本发明涉及一种婴幼儿排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的分析方法。适用于婴幼儿排泄物的快速、高通量分析。

技术背景

在婴儿的生长发育过程中，来源于母乳的寡糖起着至关重要的作用，如抗炎、抗感染、免疫调控和维持肠道菌群平衡。其中酸性寡糖在体内起着不可替代的作用，如预防癌症发生、促进婴儿脑的正常发育等功能。

深入了解婴幼儿肠道中酸性糖与其肠道菌群或其他生长发育过程关系的前提是对其中酸性糖进行组成和含量的分析，因此，发展一种简单、快速、高通量的酸性糖的定量分析方法具有重要的意义。然而，由于婴幼儿排泄物成分极为复杂多样，在分析时脂质、蛋白与色素类成分对检测器的污染严重，糖类成分中乳糖及其他中性糖对分析过程的干扰严重，酸性糖种类众多，从而增加了分析的难度。

目前，酸性糖影响婴幼儿肠道菌群平衡以及脑部发育等生长发育过程的研究备受关注，但对于能够直接测定婴幼儿体内酸性糖的含量的婴幼儿排泄物，其酸性糖的分析定量方法却尚未建立，这主要是由于排泄物中糖类含量极低，其他包括中性糖在内的复杂成分严重干扰酸性糖的检测和定量。因此，本发明设计出一种新的婴幼儿排泄物净化及分析方法，使用婴幼儿排泄物的高通量定量分析。

发明内容

本发明涉及一种婴幼儿排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的分析方法。具体为：将样品均质提取，沉淀除去蛋白后，经在线的净化柱除去色素、乳糖及其他中心糖的干扰，获得的酸性糖及酸性糖衍生物经亲水作用色谱分离，液相或质谱检测，得到婴幼儿排泄物酸性糖及酸性糖衍生物的组成和含量信息。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

对婴幼儿排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物均质提取、沉淀除蛋白，经在线系统净化柱除色素、乳糖及中性糖，获得酸性糖及酸性糖衍生物馏分，获得的酸性糖及酸性糖衍生物馏分进入亲水作用色谱(HILIC)柱进行分离，亲水作用色谱(HILIC)柱流出组分进入检测系统进行检测，获得婴幼儿排泄物酸性糖及酸性糖衍生物的结构组分分析，同时根据各酸性糖及酸性糖衍生物在本分析体系下所绘制的标准曲线，得到婴幼儿排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的绝对含量信息。

1.均质提取步骤为：取排泄物，加入其0.5-5倍体积量的糖类的良溶剂如水等，涡旋震荡不少于5秒，超声不少于1分钟，而后500-50000g离心5-500分钟，提取1-5次后，取出上层透明溶液即完成排泄物中糖类物质的提取

2.沉淀除蛋白步骤为：取排泄物提取清液，加入1-5倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃ 500-50000g离心不少于5分钟，收集上层液，离心1-5次后蒸干，得到样品。所使用的有机溶剂有甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种。

3.所述色谱柱净化酸性糖的固定相及HILIC柱固定相为极性色谱填料，包括硅胶或极性键合硅胶填料，其结构式如下：

其中SiO₂为硅胶，R为极性基团，有氨基酸、酰胺、氨基、羧基、糖基和两性离子等中的一种或几种。

4.洗脱液中的有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种。

5.缓冲盐类型及其于流动相中的浓度及pH如下：

所选择缓冲盐类型为甲酸铵缓冲盐、乙酸铵缓冲盐、碳酸氢铵缓冲盐中的一种，其于流动相中的浓度为0-200mM，pH 6-10。