[发明专利]一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞脂质过氧化影响的方法

权利要求书

1.一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞脂质过氧化影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；

mTPM＝m₁-m₀ (1)

式中：

m₀——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

m₁——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，-80℃保存待用；

(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞RPMI2650复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中，加入10mLRPMI1640细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的RPMI1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用RPMI1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用RPMI1640细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6mL，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用PBS稀释成400μg/mL的工作液备用，取出细胞培养皿，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

(6)收集细胞：移除步骤(5)细胞培养皿中的培养基，细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗一遍，加入质量浓度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的细胞用RPMI1640细胞培养基悬起，分别收集到15mL离心管中，1000rpm，4℃条件下离心10min，去上清液；

(7)细胞裂解：步骤(6)中每支离心管中加入100μL细胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃条件下离心10min，取上清液待测；

(8)标准品的配制：取丙二醛标准品用蒸馏水分别稀释至1、2、5、10、20、50μM，得到不同浓度梯度的标准品稀释液；

(9)吸光度测定：在不同的离心管内分别加入0.1mL步骤(7)中的待测上清液和不同浓度梯度的标准品稀释液，再分别加入0.2mL浓度为0.185mg/mL的硫代巴比妥酸MDA检测工作液混匀，100℃沸水浴15min，1000rpm室温离心10min；取200μL上清液加入96孔板中，酶标仪532nm测定吸光度；

(10)丙二醛含量计算：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算样品中的丙二醛含量。