[发明专利]一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法，属于生物安全技术领域；一种用于检测根串珠霉菌的引物，所述的引物为如下所示，上游引物：SEQ ID No：1，下游引物：SEQ ID No：2；用于检测根串珠霉菌的检测方法，包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，随后进行实时荧光定量PCR扩增反应；(3)分析实时荧光定量PCR扩增产物。将实时荧光定量技术应用到根串珠霉菌的分子检测方面，其采用的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，表现出特异性强、扩增效率高、灵敏度高、重现性高、实用性好的特点，为根串珠霉菌的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法，极大提升了土壤中根串珠霉菌的检测效率。

技术领域

本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法。

背景技术

由根串珠霉菌引起的烟草根黑腐病是烟草生产上的重要真菌病害之一，其通过菌丝生长和孢子萌发产生的芽管侵入寄主植物导致发病，从幼苗到成株期均可发病，主要危害根系。烟苗发病后，幼茎、子叶和根尖发黑腐烂，重病株的根系则全部腐烂，呈黑色。烟株不死，地上部分呈现生长缓慢，发黄，矮化。常与黑胫病混合发生，造成烟草损失。它遍布世界主要产烟区，在美国、加拿大、日本等国曾使烟草生产遭受严重损失，我国主要烟区也均有发生。尤其近年来，此病在一些烟区蔓延，在我国云南、贵州、湖北等省发生严重，严重地块发病率可达30％以上。山东、河南、安徽、吉林、福建等省也有发生，近年来有加重危害的趋势。

由于根黑腐病为土传病害，通常与其它烟草根茎部的病害混合发生，给病害的正确诊断造成困难。根黑腐病菌危害烟草在肉眼能够观察到病症之前称为危害早期阶段，在根黑腐病病害发生的早期阶段，不能显现出根部发黑，病斑环绕茎部、侧根、根尖变黑等烟草根黑腐病病症。通常根黑腐病菌危害烟草5-6天才能观察到病症，因此，在烟草根黑腐病害发生的早期难以针对性地进行有效防治，造成根黑腐病菌危害严重，引起较大的经济损失。因此，建立烟草根黑腐病菌特异性的快速分子检测体系，及早对发病植株或土壤中带菌病原菌快速准确地进行检测，对于及时采取科学合理的防治措施控制病害的发生、流行，减少病害造成的经济损失具有重要的指导意义。

传统用于对植物病原菌的检测鉴定方法是首先利用选择性培养基进行病原菌的分离培养，获得纯培养菌株以后，根据菌落特征、孢子形态大小等形态学特征、致病性测定、生理生化特性等进行鉴定。这些方法耗时费力，程序繁琐，且病原菌的分离鉴定经验性很强。已有研究表明，烟草根黑腐病菌不同菌株间的形态差异明显，有些菌株可产生大量的扇形白化菌株，有些白化菌株的单孢菌落可回复到野生型，鉴定时易受人为环境等诸多因素的干扰。此外，由于不能直接从植物带病组织中检测出病原菌，难以满足病害防治所需的快速、准确、灵敏的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用。基于基因组DNA的PCR技术的快速发展有效地弥补了传统分类鉴定方法的不足,其具有的特异性、灵敏性和快速性等特点成为植物病原菌分类和鉴定应用最广泛的技术之一。由于PCR技术不需要对病原菌进行分离纯化即可对植物病组织进行快速检测和诊断，因此可用于烟草根黑腐病显症前的早期诊断，为病害的准确鉴定和及时防治提供科学依据。

目前针对植物病原菌的PCR检测技术绝大部分是基于核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)序列开发的特异性引物。国内外研究人员也对烟草根黑腐病菌的rDNA-ITS序列开发了用于PCR技术的特异性扩增引物。但是越来越多的研究发现，在一些近缘种的病原菌中，rDNA-ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将它们区分开，因此需要开发一些新的基因进行检测。

康振辉等(康振辉,黄俊丽.土壤中烟草根黑腐病菌的实时定量PCR检测技术研究[J].植物病理学报,2010,40(2):210-213.)人在文章中所用的引物Tb-1/Tb-2用PCR扩增反应可扩增出334bp的产物，但其特异性较差且扩增效率低。

发明内容