[发明专利]一种β-酮脂酰-ACP合成酶突变体

说明书

本发明涉及具体涉及一种β‑酮脂酰‑ACP合成酶突变体及其应用，即通过改造源自肠杆菌科的β‑酮脂酰‑ACP合成酶(fabH)，使其能够非天然催化反应，在肠杆菌中实现新型脂肪酸的大量积累。其特征在于，所述的改造是将β‑酮脂酰‑ACP合成酶(fabH)中的189位点由亮氨酸突变为丝氨酸，和/或将157位点由苯丙氨酸突变为天冬氨酸。本发明通过结构生物学的方法，通过将β‑酮脂酰‑ACP合成酶进行位点突变，使其能够催化非天然反应。将上述突变的基因连接到质粒上，并在野生型的大肠杆菌中过量表达，大大提高了肠杆菌中脂肪酸的产量。

技术领域

本发明属于代谢工程和酶的理性设计领域，具体涉及一种β-酮脂酰-ACP合成酶突变体及其应用，即通过改造源自肠杆菌科的β-酮脂酰-ACP合成酶(fabH)，使其能够非天然催化反应，在肠杆菌中实现脂肪酸的大量积累。

背景技术

在生物体内，脂肪酸合成(FAS)途径包括两种类型：FASⅠ和FASⅡ。FASⅠ型存在于哺乳动物体内，属于高效能但产物单一的脂肪酸合成途径；FASⅡ存在于动植物、细菌、真菌等体内，此途径是一个分散的蛋白系统，脂肪酸合成的每一步都是由不同的单功能酶催化合成，代谢产物多样，靶点丰富，对于研究对抗细菌耐药性的新型抗菌药物有很大的帮助。β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅲ(fabH或KASⅢ)是细菌FASⅡ型途径中单功能酶之一。之所以选择该靶点的优势在于：①FabH酶催化细菌FAS途径的第一个缩合反应，链的延长由此启动，控制着细菌脂肪酸合成的起始，并且为后面链的延长提供底物，是反应过程中的关键酶；②细菌的脂肪酸合成酶系与人体的不同，没有同源性。因此，以fabH酶为新型抗菌药物作用靶标的抑制剂的研究成为国内外的热点。目前，国内外已报道的针对fabH靶点有抑制作用的化合物有：浅蓝菌素；硫霉菌素；平板霉素；含硫化合物；肉桂酸衍生物等。

通过过量表达酮脂酰-ACP合成酶，可实现了脂肪酸在肠杆菌中的大量积累。β-酮脂酰-ACP合成酶作为脂肪酸合成过程中关键酶，广泛存在细菌中，且与人体无同源性。然而，fabH只能催化乙酰辅酶A进行反应，因此极大的限制了能够生产的产物的种类及产量，目前，对β-酮脂酰-ACP合成酶的改造是实现新型脂肪酸生产以及高产脂肪酸的关键技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-酮脂酰-ACP合成酶突变体及其应用。对来源于肠杆菌科及其他革兰氏阴性菌细菌的fabH基因进行定点突变，使其能够催化新型底物；将带有突变型fabH基因的质粒导入埃希氏属的细菌中进行发酵生产，实现脂肪酸的积累，从而弥补现有技术的不足。

本发明的β-酮脂酰-ACP合成酶突变体，其特征在于，所述的改造是将大肠杆菌来源的β-酮脂酰-ACP合成酶中的189位点有亮氨酸突变为丝氨酸，和/或将157位点由苯丙氨酸突变为天冬氨酸。

上述的β-酮脂酰-ACP合成酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO:1-3中任一种。

本发明的另一方面涉及编码β-酮脂酰-ACP合成酶突变体的基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6中任一种。

考虑到密码子的简并性，编码本发明β-酮脂酰-ACP合成酶突变体的基因序列可以有多种，但优选为埃希氏属的偏好密码子。

本发明还包括有表达β-酮脂酰-ACP合成酶突变体的重组质粒。

本发明通过将β-酮脂酰-ACP合成酶编码基因进行点突变，使其能够催化非天然底物丁酰辅酶A的酰化反应。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步说明，在实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如萨姆布鲁克(J.Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照设备或试剂生产厂商所建议的条件运行。

实施例1、FABH突变体的获得

1.FABH野生基因的获得