[发明专利]一种改进的16S-seq方法及其应用

说明书

本发明涉及利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切植物rRNA序列的方法，属于植物附属微生物组分析技术领域。本发明提供了利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻rRNA序列的gRNA spacer序列，所述gRNA spacer的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～16任意一条序列所示。本发明提供的特异性gRNA spacer序列形成的gRNA序列能够引导Cas9实现16S‑seq测序文库中水稻rRNA序列的特异性切割，实现16S‑seq测序文库中微生物rRNA序列的富集。本发明为利用这种改进的16S‑seq技术分析植物附属微生物组的研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及植物附属微生物组分析技术领域，具体涉及一种改进的16S-seq方法及其应用。

背景技术

植物根系微生物主要分为三部分，根际，根围以及根系内生菌。富集在根系周围的微生物大多数对植物的生长发育是有益的，它们不仅能提高植物的抗病性、从土壤中获取养分的能力，而且还能分泌有益物质促进植物的生长发育。完整和部分的16S rRNA基因测序的方法已经成为鉴定微生物种类的有用工具，尤其是近年来发展迅速的高通量测序技术，具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨大等优势。16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，微生物16S rRNA基因包含9个“高度可变区”(Hypervariable Regions)，在不同的微生物中具有相当大的多样性，16S小亚基核糖体RNA基因的高通量测序(16S-Seq)技术，就是通过在16S序列保守区上设计通用引物，对一个或多个高度可变区进行扩增，然后对扩增子序列进行高通量测序，从而能够快速的鉴定出不同的微生物种类，植物附属微生物群落的结构和动态的研究就是主要运用这种扩增子深度测序的方法进行的。然而从宿主植物组织中扩增这些高度可变区的时候，由于宿主植物的植物质体和线粒体由原核生物进化形成，并且保留了微生物的16S rRNA的基因，因此，16S-seq中使用的通用引物也能扩增出宿主植物的rRNA基因，从而减少了16S-seq的测序效率。例如，当对来源于植物样品中的16S rRNA基因V4高度可变区进行测序时，来源于宿主植物的质体和线粒体序列高达所有测序序列的95％。如此高的宿主序列污染限制了同时测序的样本数量和样本的测序深度，以及16S-seq技术在描述微生物群落结构和多样性的运用价值。因此，研究一种能有效去除宿主污染的方法对于研究宿主附属微生物群落具有重要的价值。

近年来，CRISPR/Cas9系统作用机制的发现及其应用彻底改变了基因组编辑技术，Cas9内切酶在gRNA的引导下能够快速、精确且高效地切断双链DNA分子，形成双链DNA断裂(Double-stranded DNA break，DSB)。CRISPR/Cas9系统主要是由规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)与Cas9蛋白组成。利用Cas9/gRNA标靶特定的DNA位点只需满足2个条件：(1)gRNA的5’端20nt(Nucleotides)的引导序列(称为Spacer或Guide sequence)与靶DNA位点的序列(称为Protospacer)互补匹配；(2)靶位点的必需存在PAM(Protospacer-adjacentmotif)，其中使用最广的化脓链球菌Cas9的PAM序列为5’-NGG-3’。Cas基因编码的蛋白能够在sgRNA的引导下特异性切割靶位点。但是CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-12bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不明显，说明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性，本发明主要就是利用CRISPR/Cas9系统的这些特点，结合CRISPR/Cas9系统的脱靶原则设计出特异性的gRNA spacer序列，合成gRNA序列，使其能够引导Cas9蛋白体外特异性的剪切的寄主植物rRNA序列，而不剪切的微生物rRNA序列。

发明内容