[发明专利]一种适用于雷帕霉素介导调控蛋白亚细胞定位的黄酒酵母

权利要求书

1.一种构建尿素积累能力降低的黄酒酵母的方法，其特征在于，以黄酒酵母XZ-11为出发菌株，进行了MATa，Δura3，Δtrp1，TOR1 S1972R，Δfpr1的改进，构建重组黄酒酵母JNZ01；在所述黄酒酵母JNZ01的基因组上融合表达GLN3、FKBP12或是GAT1、FKBP12，并在质粒上融合表达SPT15、FRB；通过CRISPR-Cas9系统同时对FPR1基因进行敲除，并对TOR1基因进行点突变；所述CRISPR-Cas9系统包括但不限于p414-TEF1p-Cas9-CYC1t、pRS426-Tor1sgRNA-Fpr1sgRNA-URA3。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）以pRS426-URA3为出发质粒，引入sgRNA表达元件，将其分别定位在FPR1位点的20nt序列和TOR1位点的20nt序列，获得质粒pRS426-Tor1sgRNA-Fpr1sgRNA-URA3；（2）分别构建用于敲除FPR1基因的敲除框和用于突变TOR1基因的重组框；将质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t转入黄酒酵母XZ-11；（3）将质粒pRS426-Tor1sgRNA-Fpr1sgRNA-URA3、FPR1基因敲除框和TOR1基因突变重组框一起转入带有p414-TEF1p-Cas9-CYC1t的出发菌株中；筛选阳性转化子。