[发明专利]一种通用型转录组编辑载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种通用型转录组编辑载体及其制备方法，对Cas13d基因进行序列优化，并且对Cas13d进行点突变，使HEPN失活；在pCas13d‑gRNA的多克隆位点处定向插入靶向目的基因的guide RNA序列，在guide RNA的辅助作用下将Cas13d蛋白定点结合到特定的目的基因序列上；利用Cas13d蛋白结合在剪接受体的作用，进行转录组编辑。本发明基于CRISPR‑Cas13d，将HEPN无活性的dCas13d设计为灵活的RNA结合模块以靶向特定的RNA元件，实现基因组编辑并且不扰乱蛋白质翻译，为RNA研究提供了一个通用工具。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，更具体的说是涉及通用型转录组编辑载体及其构建方法，主要是在哺乳动物转录组水平进行编辑的一种通用工具。

背景技术

基因组编辑技术作为一种新型分子生物学技术自上世纪80年代末发现以来就受到广泛关注，它的迅速发展正改变着人们对真核生物基因组进行高效和定向改变的能力。其中包括对内源基因或等位基因的功能性敲除，对特定突变或基因的多态性进行靶向诱导或校正，以及对正常细胞功能的遗传贡献进行精确的建模。基因编辑技术使得人们可以按照特定的要求对基因组进行精确的修饰，这对基础科学研究、工业生物技术，特别是医学领域产生了巨大影响并得到了广泛的应用。

DNA工程技术如CRISPR-Cas9，使研究人员能够剖析特定遗传元件的功能或纠正引起疾病的突变。然而，用于研究和操作RNA的简单工具显著落后于DNA工程技术。现有的RNA干扰技术能够切割或抑制所需的转录物，但是具有显著的脱靶效应，并且由于它们在内源性过程发挥作用，使其成为仍然具有挑战性的工程目标，直接研究RNA的功能作用的方法仍然有限。

研究RNA即在转录组水平进行，在转录组水平有一至关重要的过程为可变剪接。有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接。可变剪接被认为是导致蛋白质功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码获得多个不同的转录产物和蛋白产物，可变剪接在产生受体多样性、控制调节生长发育等方面起决定性作用，许多遗传疾病都与剪接繁盛异常紧密相关。剪接需要区分外显子及内含子，识别信号主要包括内含子5’及3’末端序列及中间分支点附近的序列。内含子5’剪接点称为供体点，3’剪接点称为受体点。内含子开始和末端的两对碱基最为保守。通过不同的剪接因子与剪接位点的识别与结合完成剪接过程。可变剪接通常通过调节顺式作用在元件前mRNA具有正的或负的反式作用剪接因子，介导的外显子包含或排除。

因此，构建一种高效实用的通用型转录组编辑载体及其制备方法，在转录组水平上对基因序列编辑，介导外显子包含或排除，为研究和操作RNA提供工具，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种高效实用的通用型转录组编辑载体，在转录组水平上对基因序列编辑，介导外显子包含或排除，为研究和操作RNA提供工具。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种通用型转录组编辑载体，通过在多克隆位点处插入目的基因对应的guideRNA，即可对其转录组进行编辑。

进一步，一种通用型转录组编辑载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)对Cas13d基因的序列进行优化；优化后的Cas13d基因序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将优化后的Cas13d基因克隆到PX459载体上，同源置换出Cas9序列，获得载体pCas13d；

(3)在pCas13d的U6 promoter下游引入多克隆位点，获得载体pCas13d-gRNA；