[发明专利]一种温控裂解质粒及其构建以及在菌蜕制备中的应用在审
| 申请号： | 201811448234.7 | 申请日： | 2018-11-30 |
| 公开（公告）号： | CN109402156A | 公开（公告）日： | 2019-03-01 |
| 发明（设计）人： | 汪玮;汪浩;施慧;许文军 | 申请（专利权）人： | 浙江省海洋水产研究所 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/65;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 宁波诚源专利事务所有限公司 33102 | 代理人： | 袁忠卫;叶桂萍 |
| 地址： | 316021 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 质粒 构建 裂解 温控 卡那霉素抗性 制备 致病菌 核苷酸序 卡那霉素 抗性筛选 阳性菌株 自杀质粒 基因组 宿主菌 可用 应用 复制 遗传 敏感 | ||
1.一种温控裂解质粒，其特征在于：所述温控裂解质粒为具有卡那霉素抗性的温控裂解质粒220E-Kn，该220E-Kn的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.一种构建如权利要求1所述的温控裂解质粒的方法，其特征在于：包括有如下步骤：
(1)以噬菌体PhiX174 RFI DNA为模板，Elysis-F2、Elysis-R2为引物，扩增出噬菌体PhiX174裂解基因E，连接于pEasy-T simple克隆载体，经测序无误后，通过EcoR I和Sal I双酶切，与相同酶切的pBV220载体连接，获得携带裂解基因E的pBV220，命名为220E；
(2)以构建好的220E质粒为模板，以220F、220R为引物，通过PCR反向扩增，获得线性化的、两端带有重组臂的220E质粒；以携带卡那霉素抗性基因的pET30(a)质粒为模板，该携带卡那霉素抗性基因的pET30(a)质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，并以Km-F、Kn-R为引物，通过PCR扩增获得两端带有重组臂的卡那霉素抗性基因220E-Kn；
(3)将步骤(2)获得的线性载体和片段进行同源重组，重组产物转化Trans1-T1感受态细胞，通过卡那霉素平板筛选阳性转化子，并用载体引物pBV220-F和Elysis-R2、Kn-F和Kn-R两队引物进行PCR验证，确认获得的转化子含有携带正确重组片段的裂解质粒。
3.根据权利要求2所述构建温控裂解质粒的方法，其特征在于：所述步骤(1)中引物Elysis-F2的核苷酸序列为：gaattcATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTT；Elysis-R2的核苷酸序列为：aaaagtcgacTCACTCCTTCCGCACGTAAT。
4.根据权利要求2所述构建温控裂解质粒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中引物220F的核苷酸序列为：ctgtcagaccaagtttactcATATATACTTT；
220R的核苷酸序列为：actcttcctttttcaatattATTGAAGC。
5.根据权利要求2所述构建温控裂解质粒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中引物Km-F的核苷酸序列为：aatattgaaaaaggaagagtATGAGCCATATTCAACGGGAAA；
Kn-R的核苷酸序列为：gagtaaacttggtctgacagTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA。
6.一种如权利要求1所述的温控裂解质粒在制备菌蜕中的应用。
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