[发明专利]一种建立基于CRISPR的基因敲减肺癌细胞株的方法及细胞株

说明书

本发明公开了一种肺癌细胞株的基因编辑方法。本发明基于CRISPR/Cas 9技术进行改良，通过构建表达效率更佳的重组质粒，建立一种稳定敲减肺癌基因细胞株的方法。所需shRNA通过引物合成的方式可以保证精准获得，退火后作为插入片段装入改造过的CRISPR载体中，构建成用于敲减的shRNA重组质粒。经包装慢病毒后与肺癌细胞共孵育，通过慢病毒介导将shRNA导入肺癌细胞中，对基因编辑后的肺癌细胞进行嘌呤霉素(Puromycin)抗性筛选同时进行单克隆化培养，最终获得基因敲减阳性的稳定肺癌细胞株。本方法为研究基因在肺癌发生发展中的分子机理提供了新的实验材料，对肺癌的相关建模提供参考。

技术领域

本发明涉及肺癌研究领域中的肿瘤细胞基因编辑范畴，具体来说，本发明涉及一种肺癌细胞株的基因编辑方法。

背景技术

肺癌连续十年位居中国恶性肿瘤死亡率和发病率的榜首，俨然成为我国“第一癌”。在全世界范围内，肺癌的发病率也呈现持续上升趋势，吸烟、汽车尾气、空气污染、厨房油烟、职业粉尘等，共同促使肺癌成为“第一癌”。肺癌是一种基因异常疾病，在癌细胞中形成了数百或数千的突变，了解基因突变致癌的机理以及调控肺癌发生发展过程的重要基因功能，是肺癌研究的一个重大挑战。通常需要建立细胞模型将目标基因的表达做干扰处理，体外探讨相关基因干扰表达后的变化，从而了解该基因的功能。基因干扰和基因敲减均为研究基因生物学功能的重要技术，两者各有所长。

shRNA是short hairpin RNA的缩写，即“短发夹RNA”，是一段具有紧密发夹环的RNA序列。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子调控。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在细胞中，shRNA被加工成siRNA，发挥抑制特异mRNA表达的作用，这种装载了shRNA的载体可以通过筛选，稳定传递到子代细胞中去。载体介导shRNA表达技术能长期和稳定地抑制靶基因的表达，因此可用来构建理想的实验细胞模型，与化学合成siRNA法相比具有更大的应用潜力，因此shRNA表达载体技术成为肿瘤基因研究和治疗的强大工具。

然而，现有的shRNA表达技术用于基因敲减存在shRNA表达效率较低的问题，由于发夹结构的特异性，不同发夹结构会使其表达效率存在很大差异，发夹结构在测序时有很大影响，制备的重组质粒较难通过测序检测序列的正确性，故多不利于实验室自行制备。

本发明基于CRISPR/Cas 9技术进行改良，通过构建表达效率更佳的重组质粒，建立一种稳定敲减肺癌基因细胞株的方法。所需shRNA通过引物合成的方式可以保证精准获得，退火后作为插入片段装入改造过的CRISPR载体中，构建成用于敲减的shRNA重组质粒。本方法为研究基因在肺癌发生发展中的分子机理提供了新的实验材料，对肺癌的相关建模提供参考。

发明内容

本发明的目的是建立一种基因敲减肺癌细胞株的构建方法，基因敲减肺癌细胞株可作为细胞模型，用于研究基因对肺癌的发生发展的调控机制。

本发明通过基于CRISPR的骨架质粒去掉Cas9基因后作为母体载体构建shRNA重组质粒，能高效获得基因敲减的稳定肺癌细胞株。本发明的实验靶细胞适用于全部肺癌细胞株快速建立靶基因敲减的细胞株。由于是基于CRISPR V2质粒为骨架，将所需shRNA通过引物合成的方式获取，可以保证其精准性，引物退火后作为插入片段装入改造过的CRISPR载体中，构建成用于敲减的shRNA重组质粒。与传统用于基因敲减的质粒相比，传统方式存在shRNA表达效率较低的问题，且多不利于实验室自行制备。因此本发明在敲减质粒构建时具有简便高效及可操作性好的优势。

本发明提供的一种基因敲减肺癌细胞株的构建方法，包括如下步骤：