[发明专利]一种提高自溶链霉菌洋橄榄叶素及其衍生物产量的方法

说明书

本发明公开了一种敲除自溶链霉菌野生型菌株的orf17基因并发酵提高洋橄榄叶素及其衍生物产量的方法，属于微生物突变的基因工程及发酵方法。本发明通过敲除自溶链霉菌（Streptomyces autolyticus）orf17基因以获得突变株。进一步，采用Red/ET一步PCR法构建了orf17基因的插入突变，并通过同源重组获得其敲除突变株；并将所构建的敲除突变株进行发酵提高洋橄榄叶素及其衍生物的产量，以及HPLC检测和质谱及supgt;1/supgt;H、supgt;13/supgt;C核磁共振分析发酵产物等。本发明可大幅提高合成洋橄榄叶素及其衍生物的产量。

技术领域

本发明属于微生物突变的基因工程，及其利用所构建的菌株发酵提高特定化合物产量的方法。

背景技术

聚酮类化合物是由细菌、真菌、植物以及动物所产生的次生代谢物的一个种类，其形式极其繁多，在天然产物中具有不可替代的作用，新药开发潜力和商业价值巨大。聚酮化合物洋橄榄叶素是一种具有C2-对称性的十六元环大环内二酯类抗生素，在 Streptomycessp. DSM4137、 S. melanosporus、 S. hygroscopicusvar. azalomyceticus和 S. violaceoniger（Tu 905）等链霉菌的次级代谢产物中均有发现。洋橄榄叶素具有抗革兰阳性菌、抗线虫、抗原生动物、 免疫抑制和抗哺乳动物肿瘤细胞等多种生物学活性。 Streptomycessp. DSM4137中洋橄榄叶素 可能的生物合成基因簇已经克隆，其生物合成包括聚酮合成和糖组分的合成。

自溶链霉菌（ Streptomyces autolyticusCGMCC 0516）是从西双版纳原始森林的土壤中采集并分离得到的一株放线菌新种，它能够通过微生物代谢途径产生多种抗病毒和抗肿瘤活性化合物，其中包括格尔德霉素和洋橄榄叶素及其衍生物—11-氧-甲基洋橄榄叶素及11,11′-氧-二甲基洋橄榄叶素。但作为代谢产物的格尔德霉素在参与链霉菌活性生物合成中影响了洋橄榄叶素及其衍生物的合成，降低了产量，敲除其调控基因以提高后者的产量是所需亟待解决的问题。

发明内容

本发明旨在于提供一种能够大量产生洋橄榄叶素及其衍生物的基因工程方法，它首先旨在提供一种敲除自溶链霉菌野生型菌株的 orf17基因的方法，其次，旨在提供一种利用敲除该基因的菌株发酵提高洋橄榄叶素及衍生物产量的方法。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

（一）敲除自溶链霉菌野生型菌株的 orf17基因的方法

所述方法是：敲除自溶链霉菌（ Streptomyces autolyticus） orf17基因以获得突变株。所述的方法包括以下步骤：