[发明专利]一种能催化西他沙星五元环关键中间体的ω-转氨酶突变体

说明书

本发明公开了一种能催化西他沙星五元环关键中间体的ω‑转氨酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过对ω‑转氨酶晶体结构中B因子较高的氨基酸进行定点突变，即将ω‑转氨酶32位置处的Y突变成L，190位置处的S突变成A，212位置处的L突变成M，215位置处的I突变成M，得到了一种可以催化西他沙星五元环关键中间体的ω‑转氨酶突变体。本发明突变体Y32L/S190A/L212M/I215M催化效率Kcat/Km为0.64min^‑1·mM^‑1，催化(S)‑5‑benzyl‑5‑azaspiro[2.4]heptan‑7‑amine生成5‑benzyl‑5‑azaspiro[2.4]heptan‑7‑one时，突变体的5‑benzyl‑5‑azaspiro[2.4]heptan‑7‑one最大转化率为79.02％。本发明得到的突变体适用于在工业上手性合成西他沙星五元环关键中间体的应用。

技术领域

本发明涉及一种能催化西他沙星五元环关键中间体的ω-转氨酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

2008年日本第一制药三共株式会社开发的广谱喹诺酮类抗菌药——西他沙星(Sitafloxacin Hydrate)对许多临床常见耐氟喹诺酮类菌株具有良好杀菌作用，用于治疗严重难治性感染性疾病。与其他喹诺酮药物相比，本品的日治疗费用低，治疗效果和安全性好。但其合成工艺中的关键技术难点是不对称合成西他沙星五元环关键中间体。该工艺的不稳定、成本高、难以放大生产的技术限制严重限制了西他沙星的生产。相较于手性胺类药物的化学合成方法，其生物合成方法的酶不对称催化以其底物专一性、立体选择性强、反应条件温和、环境友好等优势受到关注。因此酶不对称催化的生物合成方法更具有研究和应用价值。

转氨酶(aminotransferase，transaminase)属于转移酶类，通常用于催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物。根据不同可变区的差异，将文献报道的不同来源的转氨酶的蛋白质序列进行比较和聚类分析，再根据亲水位点的叠加和迭代对比，我们可以将转氨酶分为4类。其中ω-转氨酶属于第二亚族，常用于制备手性胺及非天然氨基酸，如β-氨基酸。因为ω-转氨酶的大口袋结合区域比天冬氨酸转氨酶(AspATs)和芳香族转氨酶(AroATs)稍大，所以它可能能够结合比天然氨基酸体积较大的底物。转氨酶催化的反应主要有不对称合成和动力学拆分，利用酶催化合成手性胺类化合物，不仅可以大大的提高产率，还可以避免原料的浪费，以制得大量的光学纯度较高的手性胺类化合物。ω-转氨酶不仅可以应用于对外消旋体的拆分，还可以催化前体酮底物不对称合成手性胺类化合物。ω-转氨酶在制备手性胺类化合物范围较广，因此更具有应用价值。

在蛋白质分子改造中，目前常用的方法有理性设计、非理性设计和半理性设计。三种方法的主要区别在于是否充分了解酶蛋白分子结构以及是否需要使用生物信息学软件进行计算和预测。其中理性设计具有实验成本低、简单方便和时间短等优点。

虽然ω-转氨酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌中筛选出的ω-转氨酶无法特异性催化西他沙星五元环关键中间体，使之无法进一步将该ω-转氨酶应用于工业生产中，大大降低了开发和运用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明将来自Bacillus pumilus W3的ω-转氨酶(一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用.201811219769.7)进行异源表达和定点突变改造，使改造后的ω-转氨酶能够特异性催化西他沙星五元环关键中间体，对ω-转氨酶的工业化应用及推广具有深远的技术指导意义。

本发明的ω-转氨酶突变体，与亲本ω-转氨酶相比能够特异性催化西他沙星五元环关键中间体。所述亲本基因与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus W3)ω-转氨酶基因(Sequence ID：MH196528)一致，所述作为突变用的质粒模板为携带天然ω-转氨酶编码基因的载体ota3/pColdⅡ(申请号：CN201811219769.7)。