[发明专利]一种采用上转换发光免疫层析法测定己烯雌酚的方法

说明书

本发明公开了一种采用上转换发光免疫层析法测定己烯雌酚的方法，本研究采用溶剂热法合成上转换纳米颗粒(UCNPs)‑NaYF4：Yb，Er，进行表面功能化修饰，将其与己烯雌酚(DES)单克隆抗体偶联，制备荧光探针，以牛血清白蛋白一己烯雌酚(BSA—DES)偶联物和羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜，形成试纸条检测线(T线)和质控线(C线)，建立了上转换发光免疫层析试纸条快速定量检测。DES的方法。实验结果表明：此试纸条定量检测DES线性范围为25～10000 ng/mL(Y=0.43927x‑0.57647，R²=0.996)，检出限为20.84 ng/mL，单个样品检测时间为15 min，批内和批间变异系数均小于10％，特异性识别能力强，在37℃存放下7天检测值RSD的平均值约为15％。加标回收实验显示平均回收率为90.1％‑115.2％，相对标准偏差小于5％，与高效液相色谱法有较好的一致性。

技术领域

本发明属于生物检验领域。具体涉及己烯雌酚的测定方法。

背景技术

己烯雌酚(Dethylstilbestrol，DES)作为一种人工合成的雌激素药物，广泛应用于妇科病的预防和治疗，同时它还具有促进动物生长和提高饲料转化率等作用。DES可通过食物链进人人体，导致激素分泌异常、甚至乳腺癌和胚胎畸形等严重后果，因此许多国家已明令禁止将DES用于动物养殖。我国国家标准规定的DES检测方法为液相色谱-串联质谱法，目前用于DES检测的方法主要有酶联免疫分析法、高效液相色谱法、液相色谱一质谱联用法、电化学法、放射免疫法等。以上方法准确灵敏，但存在过程复杂、操作繁琐以及携带不便等缺点。因此，建立简单、灵敏、快速的检测方法十分必要。

近年来，基于荧光标记的免疫层析技术得到广泛关注，量子点(Quantum dots，QDs)为免疫层析技术的常用的荧光标记物。QDs作为免疫探针，建立了检测玉米赤霉烯酮的免疫层析方法，且灵敏度良好。段宏等利用量子点荧光微球为探针，制备免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫。稀土掺杂上转换纳米颗粒(UCNPs)是一种新型材料，其上转换发光机制源于稀土离子在红外光激发下，可以转化为高能量可见光。NaYF₄：Yb，Er为双掺的上转换稀土化合物，量子产率高，荧光稳定性好。与QDs相比，UCNPs具有稳定性好、亮度高、干扰背景几乎为零、不易光解和光漂白等优点。目前，上转换发光免疫层析技术的研究逐渐受到关注，於然等将修饰羧基的上转换颗粒用于免疫层析试纸，检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇，但抗体标记较复杂，检测范围窄。本研究以修饰醛基的UCNPs为载体，将DES单抗直接标记在颗粒表面，制备出新型的荧光探针，建立了上转换免疫层析试纸条快速定量检测DES的新方法。方法检测范围宽，操作简单，适用于大量样品现场检测。

发明内容

本文采用己烯雌酚上转换发光免疫层析方法，并基于上转换发光免疫分析仪，用于己烯雌酚的快速检测。

本发明包括以下步骤：

（1）上转换纳米材料NaYF₄：Yb，Er的合成与表面修饰：称取0.18 mmol YbCl₃·6H₂O，0.80 mmol YCl₃·7H20和0.02 mmol ErCl₃·6H₂O，加人10 mL C₁₈H₃₄0₂和30 mL C₁₈H₃₆。将溶液加热至160℃并维持30 min，形成均匀溶液，同时除去O₂和水，然后冷却至50℃。逐滴加入20 mL溶有5 mmol NaOH和8 mmol NH₄F的甲醇溶液并搅拌30 min，尽快升温至100℃除去水和甲醇。在氮气保护下迅速加热至320℃并维持1 h。反应完成后，溶液自然冷却至室温，所得产物用环己烷和乙醇洗3次，烘干备用。