[发明专利]一对特异性鉴别宽体金线蛭的引物

说明书

本发明公开了一种用于鉴定宽体金线蛭的特异性引物对，由引物KT‑5’和引物KT‑3’组成，所述引物KT‑5’和所述引物KT‑3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。采用该特异性引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有宽体金线蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有宽体金线蛭。本发明能有效得将宽体金线蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及鉴别宽体金线蛭的特异性引物对和方法、应用。

背景技术

水蛭(HIRUDO)别名马蛭、麻黄蜞、马蟥，属环节动物门蛭纲医蛭形亚目医蛭科。《神农本草经》记载：“水蛭主逐恶血、瘀血，月闭、破血瘕积聚……”，作为中药,迄今已有3000多年的历史。现代中医学认为水蛭属活血化瘀药下属分类的活血调经药，可以抑制血小板的释放、降低血脂、抑制成纤维细胞增殖；用于防治血栓疾病、控制癌症细胞转移与增值等。水蛭的功效与其抗凝血作用密切相关，其中最重要的、疗效最好的抗凝血活性物质是水蛭素(Hirudin)，它是迄今为止世界上最有效和最安全的天然凝血酶抑制剂，与胰岛素、青蒿素被称为拯救人类疾病的“世界三素”，具有极高的药用价值。

2015版《药典》规定用于药用的水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman(即宽体金线蛭)、水蛭Hirudo nippponica whitman(即日本医蛭)或柳叶蚂蟥Whitmaniaacranulata Whitman(即尖细金线蛭)。值得注意的是，世界上的水蛭有500多种，我国有97种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都是十分不相同的。发明人对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查发现，中药水蛭的资源极度紧缺；同时，水蛭的生产和贸易缺乏行业规范，来源混乱，存在着严重的相似品种水蛭品种混淆用药问题。不同品种、疗效有差异的水蛭品种混用影响水蛭中药材质量，也给临床用药带来极大的安全隐患。为了临床用药安全、准确和有效，针对外形相近的不同中药材品种建立一种有效准确的鉴定方法成为已经成为迫在眉睫的需求。

随着分子生物学迅速发展，DNA水平上的多样性研究取得突破性进展，用于药用的动植物的分子鉴定技术也日渐完善。肖凌等(水蛭DNA鉴定、活性多肽分离及其作用机制的研究，湖北中医药大学，2015年)扩增得到宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、棒纹牛蛭、日本山蛭及八目石蛭等8个物种的ITS2、COⅠ、12Sr RNA、16Sr RNA等基因片断的序列，比较此4个基因片断候选序列种内种间差异；得到12Sr RNA为医用蛭类较为合适的DNA条形码序列。CN2014101625452以DNA条形码技术鉴定宽体金线蛭，通过对标准目的基因的DNA序列测定与比对分析，根据与理论序列的相似性进行判定的物种鉴定技术。但这种方法在检测过程中迟迟没有推广起来，该方法存在着判定标准不严格、实际应用性不强等限制。具体原因主要有以下三个方面：一是过程复杂，耗时费力。DNA条形码实验需要经过提取DNA、聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物电泳验证、委托测序以及测序结果的手工校对、序列拼接、与公开序列进行比对等诸多步骤，不适用于快速、高通量的应用检测。二是，结果稳定性较差，序列测定步骤复杂，测序反应的结果收到样品前处理与反应条件的影响而质量不一，影响物种判定结论。三是，缺乏明确的判定标准，通常如果目标基因与所述理论基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断待测样品的物种。但是，根据基因不同，待测物种不同，序列在物种间的变异程度是不相同的。因此，缺乏一个稳定、准确、清晰的同源性标准进行判定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种鉴别宽体金线蛭特异性引物对，有效得将宽体金线蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：