[发明专利]鉴别水蛭品种的成套引物及方法

说明书

本发明公开了一种鉴别水蛭品种的成套引物及方法。采用该成套引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果，判断所述待测样品中是否含有或候选含有宽体金线蛭、日本医蛭或菲牛蛭这些水蛭品种，有效得将其他水蛭样品进行区分，快速、简便。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及鉴别水蛭品种的成套引物及方法。

背景技术

水蛭(HIRUDO)别名马蛭、麻黄蜞、马蟥，属环节动物门蛭纲医蛭形亚目医蛭科。《神农本草经》记载：“水蛭主逐恶血、瘀血，月闭、破血瘕积聚……”，作为中药,迄今已有3000多年的历史。现代中医学认为水蛭属活血化瘀药下属分类的活血调经药，可以抑制血小板的释放、降低血脂、抑制成纤维细胞增殖；用于防治血栓疾病、控制癌症细胞转移与增值等。水蛭的功效与其抗凝血作用密切相关，其中最重要的、疗效最好的抗凝血活性物质是水蛭素(Hirudin)，它是迄今为止世界上最有效和最安全的天然凝血酶抑制剂，与胰岛素、青蒿素被称为拯救人类疾病的“世界三素”，具有极高的药用价值。

2015版《药典》规定用于药用的水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman(即宽体金线蛭)、水蛭Hirudo nippponica whitman(即日本医蛭)或柳叶蚂蟥Whitmaniaacranulata Whitman(即尖细金线蛭)。值得注意的是，世界上的水蛭有500多种，我国有97种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都是十分不相同的。发明人对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查发现，中药水蛭的资源极度紧缺；同时，水蛭的生产和贸易缺乏行业规范，来源混乱，存在着严重的相似品种水蛭品种混淆用药问题。不同品种、疗效有差异的水蛭品种混用影响水蛭中药材质量，也给临床用药带来极大的安全隐患。为了临床用药安全、准确和有效，针对外形相近的不同中药材品种建立一种有效准确的鉴定方法成为已经成为迫在眉睫的需求。

随着分子生物学迅速发展，DNA水平上的多样性研究取得突破性进展，用于药用的动植物的分子鉴定技术也日渐完善。肖凌等(水蛭DNA鉴定、活性多肽分离及其作用机制的研究，湖北中医药大学，2015年)扩增得到宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、棒纹牛蛭、日本山蛭及八目石蛭等8个物种的ITS2、COⅠ、12Sr RNA、16Sr RNA等基因片断的序列，比较此4个基因片断候选序列种内种间差异；得到12Sr RNA为医用蛭类较为合适的DNA条形码序列。

目前对水蛭品种的鉴定选用的主要为COI和LEP两对引物，其中引物COI在动物类品种的鉴定中比较常用，由于水蛭营寄生生活，多以吸食其他动物血液为生，因此将COI引物用于水蛭样品的鉴定时，通常测序结果会出现双峰、套峰，导致测序成功率低；引物LEP是针对水蛭类品种鉴定用的，在对水蛭品种进行鉴定时可以避免污染，但仍需要对序列结果进行比对分析。由于COI和LEP两对引物的鉴定均涉及扩增产物的测序和序列的比对分析，操作周期长，同时要求操作人具有对测序结果进行序列比对分析的能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供鉴别水蛭品种的成套引物及方法，一次性将宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：