[发明专利]一种发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的方法及其应用

权利要求书

1.一种发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用发根农杆菌侵染大豆子叶诱导愈伤组织：

1）发根农杆菌准备：取发根农杆菌甘油菌进行菌液培养；

2）大豆子叶外植体准备：将成熟、无破损的大豆种子盛于培养皿中，灭菌，除菌的大豆种子去除种皮培养，收割大豆子叶用于发根农杆菌侵染；

3）发根农杆菌侵染大豆子叶：在大豆子叶背部近叶柄处切下切口，发根农杆菌滴加到子叶创伤处并进行暗培养，从创伤处长出的愈伤组织被用于SMV接种；

（2）提纯大豆花叶病毒SMV：

1）SMV在防虫温室内繁殖，繁殖寄主为大豆，在第一对真叶展开后接种，发病后2-3周内摘取病叶，进行SMV提纯；

2）将收集的新鲜病叶加入缓冲液，研磨成匀浆，过滤并收集滤液；离心取上清，静置过夜；多次离心并悬浮，获得SMV病毒粒子备用；

（3）大豆愈伤组织接种纯化的SMV粒子：

将步骤（1）中发根农杆菌诱导的大豆愈伤组织刺伤，于创伤处滴加SMV病毒粒子，继续培养；

（4）大豆发状根中SMV含量检测：

将从愈伤组织长出的大豆发状根切割回收，对大豆发状根中SMV含量进行检测。

2.根据权利要求1所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述发根农杆菌用含乙酰丁香酮的MgCl₂稀释，置于摇床上轻柔摇动后用于侵染大豆子叶。

3.根据权利要求1所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述大豆种子经氯气除菌，无菌水浸泡过夜，于次日在超净台内去除其种皮，将其播种在水琼脂上培养。

4.根据权利要求1所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述SMV病毒粒子用磷酸缓冲液稀释至浓度为50-60 μg/ml。

5.根据权利要求1所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法，其特征在于，步骤（3）所述发根农杆菌诱导的大豆愈伤组织经针刺后接种纯化的SMV病毒粒子。

6.根据权利要求1所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法，其特征在于，步骤（4）所述对大豆发状根中SMV含量进行检测的方法为qRT-PCR或ELISA。

7.根据权利要求6所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法，其特征在于，所述qRT-PCR程序为预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

8.根据权利要求6所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法，其特征在于，所述qRT-PCR包括检测SMV特异上下游引物，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。

9.一种权利要求1所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法在鉴定SMV相关基因功能中的应用。

10.一种权利要求1所述的发根农杆菌诱导的大豆发状根与大豆花叶病毒病害系统的构建方法在大豆种质对SMV的抗性鉴定中的应用。