[发明专利]一种hiPSCs来源的类脑组织产生方法

权利要求书

1.一种hiPSCs来源的类脑组织产生方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)微柱阵列芯片的制备；

(2)在芯片上诱导类脑。

2.按照权利要求要求1所述一种hiPSCs来源的类脑组织产生方法，其特征在于：所述微柱阵列芯片是由芯片外围坝结构包围微柱结构形成；用于类器官的生长,微柱结构的直径为500-1000微米，高度为500-100微米，微柱间距为50-100微米，四个微柱结构围成的区域为类脑的形成区域。

3.按照权利要求1所述一种hiPSCs来源的类脑组织产生方法，其特征在于：步骤(1)高通量微柱阵列芯片的制备，具体为：

(1)使用软蚀刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量凹陷小坑，之后对模板进行低粘附修饰，保证SU-8模板与PDMS聚合物容易分离；

(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂184按照体积比10～14：1混成均匀相，之后浇注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分钟，常温将带有结构的PDMS芯片与SU-8模板分离，得到高通量的微柱阵列PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周边用相当大小的石英环将结构封闭，放于80℃烘箱内加热至凝固，得到微阵列芯片。

4.按照权利要求1所述的一种hiPSCs来源的类脑组织产生方法其特征在于：所述的微柱阵列芯片使用时必须无菌，需要将制备好的芯片放于高温灭菌锅灭菌待用。

5.按照权利要求1所述的一种hiPSCs来源的类脑组织产生方法，其特征在于：步骤(2)在芯片上诱导3D类脑；具体为：

(1)使用高通量的小坑芯片产生拟胚体：坑状结构置于24孔板中，小坑芯片结构直径为600-800微米，深度为100-300微米，用于制备拟胚体的形成；

(2)制备拟胚体阶段，将融合度为70％-80％的hiPSCs消化成单细胞，一个六孔板里面加1.5ml含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基，之后置于24孔板中用于拟胚体的形成；

所述含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基中：ROCK inhibitor Y27632的母液与mTeSR1培养基的体积比为1：5000；

所述的ROCK inhibitor Y27632在母液中的浓度为30mM；

(3)将形成的拟胚体转移至高通量微柱芯片，并加含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培养3天，3天之后加入含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基；

所述含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培中：ROCKinhibitor Y27632的母液与KSR培养基的体积比为1:2000；Dorsomorphine的母液与KSR的体积比为1:4000.A83-01的母液与KSR的体积比为1:4000；

所述含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基中：bFGF的母液与KSR培养基的体积比为1:25000，Dorsomorphine的母液与KSR的体积比为1:4000；A83-01的母液与KSR的体积比为1:4000；

所述ROCK inhibitor Y27632在母液中的浓度为30mM；

所述Dorsomorphine在母液中的浓度为10mM；

所述A83-01在母液中的浓度为10mM；

所述bFGF在母液中的浓度为100ug/ml；

(4)到第6天时换成含有bFGF的NIM培养基，3天后换成不含bFGF的NIM培养基，加两天；

所述含有bFGF的NIM培养基中：bFGF的母液的体积与NIM培养基的体积比为：1:25000；

所述bFGF在母液中的浓度为100ug/ml；

(5)第11天时加入NDM培养基，无需使用matrigel包埋，一直诱导至30天，形成和孕期脑发育早期相似的类脑，并对其进行鉴定。