[发明专利]一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法

说明书

本发明公开一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法，包括：使用倏逝波照明样品，拍摄在某一激发强度的第一图像；改变所述的激发强度，得到对应激发强度下的第二图像；获取第一图像和第二图像的差值，除以激发强度的改变量，作为相应深度的层析信号。本发明易于操作，适用范围广，可与基于波导的倏逝波照明集成，实现片上深亚波长层析成像。

技术领域

本发明涉及显微成像领域，尤其是涉及一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法。

背景技术

在纵向实现高分辨率显微成像，对细胞分子活性研究具有重要意义。提高纵向分辨率的方法——包括三维结构光照明、光片照明技术——实现的纵向分辨率都在几百纳米量级，受到衍射极限的限制。为了打破衍射极限，满足生物医学对深亚波长量级的分辨率的需求，倏逝波被用于纵向层析成像。

然而，目前的倏逝波层析方法都是通过逐步改变全内反射角实现纵向的扫描。如公开号CN106226895A提供的一种带反馈的旋转全内反射显微装置，包括：沿光路依次设置的激光器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、分束镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜和样品；位于分束镜反射光路上的光强位置探测器，用于收集分束镜反射激光器发出照明光得到第一光点，以及收集样品处发生全反射形成的样品光得到第二光点；计算机，用于根据第一光点和第二光电的位置信息，反馈得到全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度；以及用于采集样品发出荧光的CCD。

上述现有技术需要对全内反射角进行精确控制，装置复杂。而且适用范围有限，比如在基于波导的倏逝波照明中，几乎无法改变全内反射角。开发一种适用范围广，操作方便、装置简易的深亚波长层析技术具有重要的实用价值。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法，包括：

使用倏逝波照明样品，拍摄在某一激发强度的第一图像；

改变所述的激发强度，得到对应激发强度下的第二图像；

获取第一图像和第二图像的差值，除以激发强度的改变量，作为相应深度的层析信号。

本发明中，倏逝波存在于波导表面，激发强度越强，成像的位置距离产生倏逝波的界面越远。可通过改变激发强度，实现对纵向成像深度的扫描。

优选的，激发强度的改变量为相对改变量，表示前后两个激发强度的绝对差值与初始激发强度的比值。

所述的初始激发强度为得到第一图像时的激发强度，也可以理解为未改变时的激发强度。

更具体地，改变所述的激发强度，可以是逐步增加激发强度，也可以是逐步减小激发强度；具体可根据需要旋转。

优选的，所述的样品为具有饱和光吸收效应的荧光染色样品。

优选的，将激发光耦合进入波导中，波导表面产生倏逝波，照明置于波导表面的样品。

进一步优选的，按比例逐步增加激发光的强度，实现成像深度相对于倏逝波产生的界面由近及远的扫描。

本发明可选择脉冲光或连续光作为激发光。优选的，所述激发光为脉冲光，单个脉冲的脉宽小于荧光染色剂的荧光寿命。

优选的，激光强度增加的比例与对深度的扫描步长之间的关系以及纵向分辨率为：

其中，Δz为深度扫描步长；R_z为纵向分辨率；α为脉冲光强度增加的比例，λ为激光波长；n_eff为倏逝波横向波矢分量与物空间光波矢大小的比值。