[发明专利]一种大豆GmST1基因突变体植株及其制备方法

说明书

一种大豆GmST1基因突变体植株及其制备方法，属于植物生物技术领域。本发明为了明确大豆抗花叶病毒相关基因的抗病功能，提出了一种大豆GmST1基因突变体植株的制备方法，包括如下步骤：根据大豆GmST1基因设计gRNA单靶点引物；制备gRNA单靶点引物二聚体；将引物二聚体插入到Cas9/gRNA载体中，构建大豆GmST1基因敲除载体；将步骤3)构建的GmST1基因敲除载体转化大豆，经筛选获得大豆GmST1基因突变体植株。本发明确定了GmST1能够参与到抗大豆花叶病毒病的抗性反应中，为大豆抗花叶病毒相关基因功能的研究提供了理论依据。

技术领域

本发明涉及一种植物生物技术领域，具体涉及一种大豆GmST1基因突变体植株及其制备方法。

背景技术

大豆花叶病毒病由大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus，SMV)引起，是影响大豆产量和品质最严重的病毒性病害之一。在我国东北大豆主产区，N1和N3毒株为优势株系，其导致的大豆植株非正常生长可造成大豆大面积减产25％-60％，严重时甚至绝产。由于传统育种方法的局限性，因此利用分子手段筛选及鉴定有效的抗病基因，对抗病品种的选育便显得尤为重要，这为选育抗病品种提高了效率和准确性，加快了选育抗病品种的进程。由于大豆基因组庞大且大豆存在的多倍体化现象及低转化率等问题，对抗病基因的功能分析增加了难度。

发明内容

本发明为了明确大豆抗花叶病毒相关基因的抗病功能，本发明提供了一种大豆GmST1基因突变体植株，所述突变体植株含有突变的大豆GmST1基因，所述突变是指GmST1基因编码区中5’AGAAAGGGGAGGAAATAA3’或5’CTTCCTAGGGAGAGAGGT 3’核苷酸序列发生碱基取代或缺失，使其编码的氨基酸序列发生改变，所述大豆GmST1基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述大豆GmST1基因突变体植株的制备方法，包括如下步骤：

1)根据大豆GmST1基因设计gRNA单靶点引物；

2)制备gRNA单靶点引物二聚体；

3)将引物二聚体插入到Cas9/gRNA载体中，构建大豆GmST1基因敲除载体；

4)将步骤3)构建的GmST1基因敲除载体转化大豆，经筛选获得大豆GmST1基因突变体植株。

进一步地限定，步骤1)所述大豆GmST1gRNA单靶点引物的正向引物为GmST1-1-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物为GmST1-1-A，其核苷酸序列SEQ ID NO:3所示；或者正向引物为GmST1-2-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，反向引物为GmST1-2-A，其核苷酸序列SEQ ID NO：5所示。

进一步地限定，步骤2)所述制备gRNA单靶点引物二聚体，是指每20uL合成体系中正向引物5μL，正向引物5μL和H₂O 15μL，反应条件为95℃3min，冷却至25℃后，16℃静置5min。

进一步地限定，步骤3)所述构建GmST1基因敲除载体，是指每10uL反应体系中，引物二聚体1-7μL，Cas9/gRNA vector，1μL，Solution1 1μL，Solution2 1μL，H₂O 0-6μL，16℃过夜反应。

进一步地限定，步骤4)所述GmST1基因敲除载体通过农杆菌介导法转化大豆；所述农杆菌为农杆菌EHA105。

进一步地限定，步骤4)所述大豆为东农93-046。

进一步地限定，步骤4)所述筛选所用正向引物为CasJC-S，其核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示，反向引物为CasJC-A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，用于筛选阳性突变体植株。