[发明专利]一种大腹园蛛梨状腺丝蛋白的基因及其制备方法在审
| 申请号： | 201811456388.0 | 申请日： | 2018-11-30 |
| 公开（公告）号： | CN109371035A | 公开（公告）日： | 2019-02-22 |
| 发明（设计）人： | 温睿;孟清;王康康 | 申请（专利权）人： | 东华大学 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/10;C07K14/435 |
| 代理公司： | 上海泰能知识产权代理事务所 31233 | 代理人： | 黄志达 |
| 地址： | 201620 上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 梨状 丝蛋白 扩增 制备 基因 设计一对引物 基因核苷酸 阳性克隆菌 编码基因 蛋白基因 基因序列 全长测序 简并PCR 锚定PCR 平末端 丝纤维 重复区 测序 抽提 质粒 克隆 研究 | ||
1.一种如SEQ ID NO.1所示的大腹园蛛梨状腺丝蛋白的基因。
2.一种大腹园蛛梨状腺丝蛋白的基因的制备方法，包括：
(1)根据蜘蛛梨状腺丝的PySp1蛋白基因，在NT端简并引物，在重复区设计特异性引物，通过简并PCR扩增得到部分的NT端基因序列；
(2)根据步骤(1)所获得的序列分别设计特异性引物及锚定引物，通过锚定PCR将NT端补齐；
(3)根据步骤(2)所获得的包含完整NT端序列，在NT端5’末端设计1条正向引物，在CT端3’末端设计1条反向引物，用于扩增全长PySp1基因；
(4)对步骤(3)所得PCR产物进行琼脂糖凝胶切胶回收后，与载体进行平末端连接反应，之后进行连接产物回收；
(5)对步骤(4)的连接产物进行平末端克隆，转入DH5α感受态细胞中进行转化，复苏，将转化后的菌液涂布在LB固体培养基上，过夜培养后，挑取单克隆进行PCR检测；
(6)将步骤(5)中得到的阳性单克隆的质粒进行完整测序，最终得到大腹园蛛梨状腺丝蛋白全长基因。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中用于扩增部分NT端的引物：正向简并引物：ATGTTYCARATGAGTTCAATG；
反向重复区特异性引物：CTGTTGTGTTTGAGCGGATTG。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中用于补全NT端的特异性引物：
引物1：TTTCAATAGCTGCCGCCTGC；
引物2：GTGGCAATAGCTTGGGTTACGC；
锚定引物：ACTCCTGTGGAACCATCGGACGGGGGG。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中锚定PCR条件为：在第一轮PCR中，使用特异性引物1进行单引物扩增；之后将PCR产物进行琼脂糖凝胶切胶回收，用TdT酶进行加多聚dCTP反应，产物回收后进行第二轮PCR；使用特异性引物2以及锚定引物进行扩增。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中用于扩增全长PySp1基因的引物：正向引物：ATGTCTTGGACCCTGGGGCTTCAGTTTTTATTC；
反向引物：CTATCCAAGTGCTGCAAGTACGAC。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中用于扩增全长PySp1基因的酶为Phanta高保真酶。
8.一种大腹园蛛梨状腺丝蛋白的基因的应用。
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