[发明专利]西洋参多肽的富集和表征方法

说明书

本发明公开了西洋参多肽的富集和表征方法。首先制备西洋参提取液；向西洋参提取液中加入乙酸乙酯，得到含有乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；向不含乙酸乙酯的萃取液中加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的含水层萃取液；将含水层萃取液超滤后离心，收集上清液，进行HPLC梯度洗脱，洗脱液即含富集的西洋参多肽。随后用质谱技术和蛋白质组学分析数据库对所富集的多肽进行表征。

技术领域

本发明属于分离分析、植物组学及生物技术领域，涉及一种从植物复杂成分中有效筛选多肽并富集多肽并基于先进质谱技术进行跟踪、检测，并通过现代质谱技术表征目标多肽的方法。

背景技术

肽是由20种编码氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，被报道的多种植物寡肽、环肽、环肽生物碱、糖肽等，都从不同角度表现出可喜的生理和药理活性，植物中的肽参与多种生理过程,包括生长发育的调节、免疫、遗传变异的估计，突变体的表征，以及植物生长的不同因素的确定。肽是研究基因动态表达的有效方法,在新的治疗方案中可能具有潜力，开发前景广阔。

我国天然产物的化学研究集中在小分子组分，对水溶性较强的多肽研究留存大量的研究空白。西洋参具有抗肿瘤，抗氧化和神经保护作用等。人参皂苷被认为是该物种的主要活性成分。我们的研究团队已经在人参中鉴定出总共308种肽。然而，因为其整个基因组尚未测序，对西洋参中的肽知之甚少。为此有必要从全面的物质基础出发，系统认识西洋参中的多肽及组成特征。

发明内容

鉴于现有技术中存在的不足，本发明建立了基于液质联用技术来筛选多肽，并跟踪和检测目标多肽达到富集纯化。利用质谱的不同碎裂模式，通过对富集后的目标多肽进行质量和碎片离子的匹配，实现对西洋参的高丰度多肽进行深度表征。本发明可以对内源性西洋参肽序列进行深度认识，进而为后续生物活性研究提供筛选。

本发明的一方面提供了一种西洋参多肽的富集方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)制备西洋参提取液；

b)向所述西洋参提取液中加入乙酸乙酯，得到含有乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；

c)向所述不含乙酸乙酯的萃取液中加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的含水层萃取液；

d)将所述不含正丁醇的含水层萃取液超滤后离心，收集上清液；

e)将步骤d)中的上清液进行HPLC梯度洗脱，洗脱液即含富集的西洋参多肽。

在优选的实施方式中，所述步骤a)包括：

1)将西洋参样品中加入体积比为0％-70％乙醇水溶液为提取溶剂，西洋参粉末与溶剂的质量体积比为0.1g/ml-0.3g/ml；

2)将步骤1)中的混合物超声分离，收集溶剂；

3)重复步骤1)中提取溶剂的提取步骤和步骤2)中的超声分离，重复提取n次，n为大于等于1的整数，合并各次提取液；

4)将步骤3)所得溶液在氮气氛下干燥，然后将所得干燥物用水重新溶解，并将所得溶液加入到高浓度乙醇中进行醇沉，所得沉淀物用水再次溶解。

在优选的实施方式中，所述醇沉步骤中的乙醇为纯度大于70％的乙醇。

在优选的实施方式中，所述步骤d)使用截止分子量为1-3kDa的离心过滤装置进行超滤。

在优选的实施方式中，步骤e)使用C18色谱柱，进行如下梯度洗脱分析、分离：

分离柱为5um Cosmosil-C18 4.6ID×250mm，二元洗脱体系含有0.2～0.5％甲酸水溶液作为流动相A和乙腈B相，在梯度条件下实现分离。在梯度为30％乙腈，35％乙腈内，富集到目标多肽。