[发明专利]杨树次生木质部原生质体环状RNA过表达体系的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种杨树次生木质部原生质体环状RNA过表达体系的构建方法及应用，属于基因工程技术领域。其构建方法包括以下步骤：环状RNA的分子生物学验证；环状RNA过表达重组质粒的构建；PEG介导重组质粒转化杨树原生质体；已转化重组质粒原生质体中的环状RNA过表达情况的分子生物学检测。该过表达体系能够被应用于宿主基因转录后表达情况的调控。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及杨树次生木质部原生质体环状RNA过表达体系的构建方法及应用。

背景技术

环状RNA是近年来引起科学家广泛关注的一类非编码RNA，也是RNA领域最新的研究热点。根据环状RNA剪接来源的不同，将其分为外显子环化形成的环状RNA、内含子环化形成的环状RNA以及环化外显子中间保留了内含子得到的外显子-内含子环状RNA，与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，环状RNA呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解，种类繁多，且有些环状RNA高于其相应的线性RNA 10倍之多。由于环状RNA具有稳定性、miRNA海绵体、广泛性、时空特异性、保守性以及组织特异性等特点，使得其可以调控神经发育、衰老和肿瘤等重要生物学过程，也预示着它在未来可能成为一种新型的生物标志物。

生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关，基因研究一直是科研界的热点和重点，环状RNA是基因的一种特殊存在方式。植物中环状RNA普遍存在，对拟南芥和水稻中的环状RNA的研究较多，但在林木中对环状RNA的研究几乎处于空白状态。基于环状RNA的特殊性质，为了研究其对基因表达和转录后调控的影响，则需采用遗传转化方法将其在细胞中大量表达，然而，当下林木遗传转化工作还停留在转化效率低、周期长的瓶颈上，利用传统的遗传转化体系研究环状RNA的调控机制是非常耗时耗力的事情。并且，环状RNA在动物中的研究较为成熟，在植物中环状RNA的研究长期停留在拟南芥和水稻这两种植物上，在林木上的研究甚少，所以研究环状RNA在林木中对基因表达和转录后调控需另辟捷径。

为了探究林木中环状RNA对基因表达和转录后调控作用，需要探索一种能够高效遗传转化环状RNA的方法，于是需要研究者选择适当的表达系统，根据该表达系统的成功率和对基因表达调控规律的深刻认识，构建合适的表达框架。到目前为止，在林木中没有发现过表达环状RNA体系的相关报道，且本研究中采用的方法更为先进：

采用两步法验证环状RNA的真实性，RNase R消化线性转录本，富集环状转录本为第一步，一代测序法验证环状RNA序列在Back-splicing junction处首尾相接为第二步；

采用天然线性宿主基因的DNA为模板构建载体，减少了多段基因及复杂酶切位点的人工连接工作；

采用35S启动子双驱动目的基因和GFP的终载体，强启动目的基因和GFP的表达；以直接、快速、稳定的原生质体方法进行转化，以观察GFP荧光效率初步判定环状RNA的过表达体系成功；

为解决遗传转化效率低、周期长的问题，转化原生质体的方法只需经过12 h的培养即可达到稳定表达，然后研究过表达环状RNA对基因表达及转录后调控的影响。这是首次在林木树种（杨树次生木质部）原生质体中实现环状RNA过表达体系的建立，其效率远高于普通的遗传转化体系，可以特异性研究环状RNA对宿主基因在转录水平和转录后水平的表达调控。

发明内容

本发明的目的在于提供杨树次生木质部原生质体环状RNA过表达体系的构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种杨树次生木质部原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，包括以下步骤：

（1）环状RNA的分子生物学验证：依据转录组测序所得环状RNA基因序列，设计相应环状RNA基因的“背靠背”引物，PCR扩增、测序，实验验证环状RNA基因的真实性；