[发明专利]一种气单胞菌多价DNA疫苗的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种气单胞菌多价DNA疫苗的制备方法及其应用，属于水产动物病害防治技术领域。本发明的技术方案要点为：设计用于扩增嗜水气单胞菌主要粘附素基因的特异性引物，引物序列为mah‑F：5’CGCGGATCCATGAAAAAGACAATTCTGGC 3’；mah‑R：5’CCCAAGCTTTTAGAAGTTGTATTGCAGGG 3’，下划线为酶切位点；细菌培养并提取嗜水气单胞菌DNA；扩增嗜水气单胞菌主要粘附素基因片段，以pcDNA3.1质粒为载体，构建重组质粒并测序验证，命名为mah‑pcDNA3.1重组质粒即气单胞菌多价DNA疫苗。本发明的DNA疫苗通过养殖鱼类免疫接种含mah基因的重组疫苗，在鱼体内产生主要粘附素蛋白并调控抗感染免疫相关基因的表达，从而有效防治多种气单胞菌的感染。

技术领域

本发明属于水产动物病害防治技术领域，具体涉及一种气单胞菌多价DNA疫苗的制备方法及其应用。

背景技术

气单胞菌是一大类广泛存在于各种淡水养殖水体中的病原病，它能引起多种水生动物发病，以导致水产动物出血症，给水产养殖业造成严重的经济损失，是我国淡水养殖鱼类暴发性传染病的主要病原。此外，气单胞菌不仅感染淡水鱼类，还是人-畜-鱼共患的致病微生物，能引起动物局部感染或全身性败血症，甚至引起人的急性胃肠炎、败血症、伤口感染、中耳炎、腹膜炎等。随着人们对水产品消费量的不断增加，其作为致病微生物的地位已被确定，并且日益成为当前食品公共卫生关注的重要对象，受到水产学界、兽医学界和医学界的广泛重视。因此，有效防控气单胞菌引起的水产动物疾病对水产养殖和水产品质量安全有着极其重要的意义。

嗜水气单胞菌是气单胞菌属中最常见的病原菌之一，其感染过程包括粘附、侵入、繁殖等。鉴于嗜水气单胞菌所致病给淡水养殖业造成的惨重经济损失，人们一直致力于寻找一种安全、有效的预防方法。鱼用疫苗作为一种新型防病措施，具有安全、卫生、高效的特性，越来越受到世界各国的认可和重视，成为逐步取代传统的抗生素防病方式。传统的疫苗主要是减毒活苗和灭活菌苗，这些疫苗已被广泛生产使用，但是也存在许多缺点。核酸疫苗作为第三代疫苗技术，是指将候选的抗原基因克隆到载体，而不是基因工程菌株或细胞中，通过转移到宿主细胞中表达抗原蛋白，进而诱导宿主自身的特异性免疫保护功能，达到抵御病原菌感染的作用。大量研究表明，DNA疫苗能够诱导鱼体内的抗原特异性免疫和细胞免疫，此外，抗原蛋白的表达还能诱导淋巴细胞分化出细胞毒素T细胞(CTLs)，细胞毒素T细胞能杀死病原细胞或通过非细胞溶解方式抑制病原菌感染。作为最新的疫苗技术，DNA疫苗既安全又有诱导全方位免疫应答的能力，并且具有易于构建，制备简单，稳定性高，能够产生高效免疫保护作用且能够大规模生产使用的优点，受到广泛关注。

嗜水气单胞菌血清型众多，生化表型和抗原性复杂，选择保护性抗原尤为重要。目前关于核酸疫苗研究主要集中在细菌外膜蛋白，如OmpA、OmpW、孔蛋白(porin)和Omp38等蛋白。粘附素在嗜水气单胞菌侵染宿主的过程中起着重要的粘附作用和抗原保护性，不但能激发机体的包括体液免疫在内的多种免疫机制，还可以与不同血清型病原菌产生免疫交叉反应，是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。有研究表明克隆表达嗜水气单胞菌粘附素融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，粘附素可以显著降低细菌对宿主的粘附作用，实现阻断病原细菌对宿主的侵袭，突破嗜水气单胞菌血清型众多的障碍，有效防止嗜水气单胞菌的感染。然而，目前还没有粘附素核酸疫苗的报道。因此，本发明提供了一种气单胞菌mahDNA疫苗的构建方法，并验证了该DNA疫苗在鱼病防治中的应用。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种新型气单胞菌多价DNA疫苗的制备方法及其应用，该多价DNA疫苗是通过养殖鱼类免疫接种含mah基因的重组疫苗，在鱼体内产生主要粘附素蛋白并调控抗感染免疫相关基因的表达，从而有效防治多种气单胞菌的感染。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种气单胞菌多价DNA疫苗的制备方法，其特征在于具体过程为：