[发明专利]一种人成体神经干细胞的制备方法及其防治脑卒中的用途

说明书

本发明公开了一种人成体神经干细胞的制备方法及其防治脑卒中的用途。具体而言，此种方法建立的细胞系高表达神经干细胞标记物Nestin、Musashi、Sox2、CD133等，传代至P20代时依然保持较高的干性，稳定性高。此细胞系培养上清对过氧化氢、氧糖剥夺所致神经细胞损伤具有显著改善作用，对脑卒中急性期及后遗症期动物模型均具有显著改善作用，可以作为脑卒中防治药物应用。

技术领域

本发明属于细胞生物学、神经药理学领域，具体涉及一种人成体神经干细胞的制备方法及其防治脑卒中的用途。

背景技术

我国已进入老龄化社会，老龄化速度已快于总人口增长速度。各种老年病患者人数和比例也呈上升趋势。脑卒中作为中老年人的多见病，在我国已经成为了仅次于心血管病的第二大死亡杀手，严重威胁人类生命健康。目前尚未有防治此类疾病的特效药物，因此开发出具有靶向性、副作用小、能有效控制病情的药物势在必行。

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。近年来，随着干细胞技术的研究和发展，研究人员发现神经系统损伤疾病发生时损伤丢失的神经细胞可以通过移植干细胞来修复，且这种方法十分有效。

但是，常规NSCs培养方法最终能获得的细胞数量有限，不能满足临床治疗需要。一方面，要达到对多人的治疗效果，通常需要获得多个胚胎组织样本，如此存在较大的伦理学争议。另一方面，不同样本来源的细胞生物学性状存在差异，由此导致的结果也存在一定的变异性，因而影响了科学数据的准确性。因此，建立稳定的可长期扩增的 NSCs细胞系，此细胞系在传代20代以上时，依然保持NSCs生物学性状不变，可以有效的进行临床研究。

发明内容

鉴于以上问题，本发明的主要目的在于提供一种人成体神经干细胞系的建立方法及其在脑卒中防治中的用途。

本发明提供的该种神经干细胞的传代方法，包括神经干细胞培养基和神经干细胞传代培养两个步骤。

所述神经干细胞传代培养基由基础培养基、B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、腐胺、Notch 1、WNT3a、黄体酮、亚硒酸钠、胰岛素生长因子、层粘蛋白组成；B27为1×，表皮生长因子浓度20ng/ml，成纤维细胞生长因子浓度20 ng/ml，胰岛素10mg/ml，腐胺16.2mg/L，Notch 150nmol/L，WNT3a20nmol/L，黄体酮20nmol/L，亚硒酸钠5ug/L，胰岛素生长因子25mg/ml，层粘蛋白5μg/ml，所述基础培养基由DMEM/F12、HEPES和碳酸氢钠组成，其中，DMEM/F12为1×，HEPES 浓度为20mmol/L，碳酸氢钠浓度为10mmol/L。

其中，所述神经干细胞传代培养具体包括以下步骤：

1).半量换液及收集神经干细胞条件培养基：当神经干细胞原代培养的半数神经球直径超过150μm时，竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞原代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养。再将上述吸出的半量培养基收集到离心管中，500g/min离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；

2).预处理：在神经干细胞传代前一天，向新的T75细胞培养瓶中加入5ml神经干细胞条件培养基，备用；

3).消化传代：当神经干细胞培养7-9天约半数神经球直径超过250μm时，将神经干细胞及培养基收集到50ml离心管中，500g/min离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用。将神经干细胞球重悬于10倍体积Accutase消化液中，置于37℃培养箱消化10分钟，待可见细胞球略微松散时，加入胰酶抑制剂终止消化，采用巴斯德吸管将细胞轻轻吹打分散；500g/min，5分钟，离心收集细胞；