[发明专利]一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高产L‑苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明是以大肠杆菌CICC20905作为出发菌株，采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术，替换高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为强启动子T7；敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB，减少发酵过程苏氨酸的代谢消耗；替换赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG，削弱赖氨酸的合成。最终得到积累L‑苏氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到30g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L‑苏氨酸奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。

目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-苏氨酸应用最广泛的方法。广东肇庆星湖生物科技公司王焕章掣以大肠杆菌K12为出发菌株，利用Red重组敲除苏氨酸脱氨酶基因，筛选异亮氨酸营养缺陷型菌株，再过表达苏氨酸操纵子基因，成功构建大肠杆菌THR6，其发酵32h产L-苏氨酸可达75g/L。华东理工大学沈琼通过强化L-苏氨酸合成途径关键酶和L-苏氨酸分泌有关基因，构建基因工程菌E coli VNBKB.3507，其发酵48h产L-苏氨酸52.7g/L。Lee等运用系统生物学方法从E coli W3100(1acI-)出发，构建的工程菌株发酵50h产L一苏氨酸82.4g/L，糖酸转化率为39.3％。

大肠杆菌(Escherichia coli)已经被应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-苏氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在大肠杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对大肠杆菌进行遗传改造的方法，对于氨基酸生产领域有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产L-苏氨酸的重组大肠杆菌，替换了高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。

在本发明的一种实施方式中，是替换了高丝氨酸激酶编码基因thrABC基因簇启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。

在本发明的一种实施方式中，高丝氨酸激酶编码基因thrABC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因dapA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，是对大肠杆菌CICC20905进行基因组编辑得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。

本发明的第二个目的是提供上述的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：