[发明专利]筛选高繁殖力黄喉拟水龟母本的SNP标记及拷贝数变异方法

说明书

本发明属于分子标记辅助育种技术领域，公开了一种筛选高繁殖力黄喉拟水龟母本的SNP标记及拷贝数变异方法，包括：获得候选母本的DNA；筛选3个SNP位点的ND1片段引物以及ND4和ATP6拷贝数的引物；PCR扩增获得ND1片段以及将ND4和ATP6的扩增片段导入质粒；测序以及根据质粒浓度获得ND4和ATP6的拷贝数；根据SNP位点以及ND4和ATP6的拷贝数进行高繁殖力个体的筛选。本发明利用多重PCR技术进行亲子鉴定，确定每个母本的繁殖能力；按照繁殖能力从高到低排列，选取繁殖能力最高的雌龟构建高繁殖力组；本发明可用于构建基础群体进行后续的良种选育工作。

技术领域

本发明属于分子标记辅助育种技术领域，尤其涉及一种筛选高繁殖力黄喉拟水龟母本的SNP标记及拷贝数变异方法。具体涉及一种可用于筛选高繁殖能力黄喉拟水龟母本的线粒体基因SNP标记和拷贝数变异的鉴定及应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

线粒体中发生的氧化磷酸化产生的能量是有机体繁殖成功的关键。作为第三代遗传标记，单核苷酸多态性(SNP)广泛分布于包括线粒体基因组在内的整个基因组中。线粒体基因不仅突变频率高，而且突变带来的变异对生物的繁殖产生了重要影响，涉及受精能力，精子活力以及卵巢功能障碍等方面。拷贝数变异(Copy number variation)是近年来新发现的一种变异片段覆盖整个基因组，且变异的核苷酸总数远超过SNP位点总数的基因组结构变异。拷贝数变异在线粒体基因中比较常见，线粒体DNA拷贝数的稳定有利于卵母细胞的发育，受精率的维持以及受精卵着床和胚胎发育。目前，有关线粒体基因SNP和拷贝数变异与繁殖能力的研究主要在哺乳动物中有过报道。尚未见到两者对龟类繁殖能力的影响方面的报道。

黄喉拟水龟是我国重要的具有经济，药用和观赏价值的淡水龟类之一，是新兴的水产养殖品种之一。黄喉拟水龟一般4-5年性成熟，每年4-8月繁殖，平均每只雌龟每年获苗4-5只。随着黄喉拟水龟人工养殖规模持续扩大，苗种产量成为困扰该产业发展的一个问题。在实际养殖生产中通过对繁殖群体加强饲养，尤其是提高食物质和量，可以有效的使繁殖群体获得较多的卵数。由于繁殖个体之间存在繁殖力差异现象，因此，除加强营养之外，如何从黄喉拟水龟繁殖群体内进行挖掘，筛选出一批繁殖能力强的个体作为繁殖群体，以促进该产业的持续发展是需要解决的问题。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中，没有从能量利用角度，筛选和鉴定出与雌龟繁殖能力相关的线粒体基因突变位点和拷贝数，没有以此推进高繁殖力品系的选育，为该产业的可持续发展提供丰富的遗传资源。

(2)目前，传统的选育方法主要为群体选育，然而，由于黄喉拟水龟性成熟时间长，从幼苗到性成熟一般需4-5年，如此漫长的性成熟周期不利于黄喉拟水龟的的世代选育。

(3)黄喉拟水龟不具有护卵行为，且产卵量存在个体差异，常规的选育方法无法准确筛选到繁殖能力强(比如产卵量多)的个体。

解决上述技术问题的难度和意义：

难度：(1)黄喉拟水龟不具有护卵行为，因此常规方法无法确定个体的繁殖能力；(2)利用群体选育方法进行黄喉拟水龟高繁殖能力个体的筛选，需要至少进行3代选育才能确定具有稳定遗传能力的个体，选育周期过长。

意义：通过解决以上技术问题，一方面可以利用分子标记辅助育种选择繁殖能力强的群体作为候选亲本，同时淘汰繁殖能力弱的个体，提高人力物力和财力的利用率，另一方面可以直接对利用分子标记筛选到的具有高繁殖能力的幼体进行强化培育，提高选育效率，缩短育种周期，从而加快黄喉拟水龟产业的可持续发展。

发明内容