[发明专利]腈基水解酶突变体及其在(S)-单腈单酸合成中的应用

说明书

本发明提供了一种腈基水解酶突变体及其在(S)‑单腈单酸化合物合成中的应用，具体地，本发明提供了一种合成(S)‑单腈单酸化合物的腈基水解酶突变体，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化二腈类化合物生成(S)‑单腈单酸催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的腈基水解酶的2个或2个以上的与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变。本发明的腈基水解酶突变体可以显著提高腈基水解酶的催化活性、提高(S)单腈单酸的产率、时空产率、和ee。

技术领域

本发明涉及酶及酶工程领域，具体地，本发明涉及腈基水解酶突变体及其在(S)-单腈单酸化合物合成中的应用。

背景技术

二腈类化合物选择性水解生成的(S)-单腈单酸化合物是合成γ-氨基酸的重要前体物质，γ-氨基酸因其生物活性及药物重要性而受到越来越多的关注。他们是市售药物关键的前体物质。例如，巴氯酚，及其前体药物普阿氯芬；闭环产物咯利普兰等。如图1。

3-(4-氯苯基)戊二腈的氰基的选择性水解是合成巴氯酚关键中间体的有效途径。巴氯酚(式I)属于手性γ-氨基酸，是作用于神经递质GABA药物之一，为解痉药。巴氯酚能抑制单突触和多突触的脊髓传递，机制在于激动GABA-受体而使兴奋性氨基酸谷氨酸及天门冬氨酸的释放受到抑制。因而减轻脊髓病变、多发性硬化、脊髓损伤所致的机体肌张力增高。用于脊髓及大脑疾病或损伤引起的肌肉痉挛。巴氯酚目前是我国市场上治疗癫痫以及脑卒中后偏瘫等痉挛疾病的主要口服药物试剂，且是目前最有效而副作用最少的肌肉松弛剂。

制备过程:

目前巴氯酚的合成方法是由对氯苯甲醛与乙酰乙酸乙酯缩合生成对氯代苯甲基-双-乙酰乙酸乙酯。加热水解得对氯代苯基戊二酸。用乙酐脱水环合生成对氯代苯基戊二酸酐。再用浓氨水胺化生成对氯代苯基戊二酸亚酰胺，最后开环、降解得对氯苯胺酪酸。其最后开环、降解具体操作方法如下：将42.24gβ-(对氯苯基)戊二酸亚酰胺在搅拌下加入到含8.32g氢氧化钠的200ml水溶液中。混合物于50℃加热10min，冷却至10-15℃，滴加含有40.9g氢氧化钠的200ml水溶液，20min后，加38.8g溴，在20-25℃搅拌8h，用浓盐酸仔细地将反应液的pH值调至7，随后即沉降出细的β-(对氯苯基)-γ-氨基丁酸结晶，再由水中重结晶。该方法需添加强酸强碱溶液，反应条件苛刻，同时伴有大量盐类形成，对环境不友好。且合成过程中ee值较低。

采用微生物或者酶水解，能够解决化学合成路线中存在的反应条件苛刻，ee值过低，及二腈到单腈单酸的区域选择性水解的问题，而且对环境友好，符合原子经济学原理和国家绿色化学发展的前进方向。2000年，王梅祥等利用红球菌Rhodococcus sp.AJ270细胞在催化转化72h后选择性水解3-(4-氯苯基)-戊二腈生成(S)-4-氰基-(3-4-氯苯基)-丁酸，转化产物ee值仅为26％，在体系中添加丙酮后提高至63％。本课题组徐美珍构建来源于G.intermedia的重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-Nit用于催化水解3-(4-氯苯基)-戊二腈生成(S)-4-氰基-(3-4-氯苯基)-丁酸，ee值可达到99％，时空产率为11.2g/(L.d)。催化效率较低。

因此本领域迫切需要开发高效的腈水解酶，从而实现(S)-单腈单酸的高立体选择性、高产量的转化。

发明内容

本发明提供了一种高效的腈基水解酶，从而实现(S)-单腈单酸的高立体选择性合成。

本发明第一方面提供了一种腈基水解酶突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有水解二腈类化合物生成(S)单腈单酸的催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的腈基水解酶的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组的三个或三个以上与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：

第59位酪氨酸(I)；

第64位苯丙氨酸(E)；