[发明专利]检测水稻光温敏雄性不育基因tms9-1和pms3的KASP标记引物及其应用

权利要求书

1.一种检测水稻光温敏雄性不育基因tms9-1和pms3的KASP标记引物，其特征在于，包括检测tms9-1基因的Ktms9-1引物组和检测pms3基因的Kpms3引物组；

所述Ktms9-1引物组包括Ktms9-1正向引物1、Ktms9-1正向引物2、Ktms9-1反向引物、淬灭探针1和淬灭探针2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.8和SEQ ID NO.10所示；

所述Kpms3引物组包括Kpms3正向引物1、Kpms3正向引物2、Kpms3反向引物、淬灭探针1和淬灭探针2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示。

2.根据权利要求1所述的检测水稻光温敏雄性不育基因tms9-1和pms3的KASP标记引物，其特征在于，淬灭探针1和淬灭探针2的3’端均连接一个BXQ淬灭基团；所述的Ktms9-1正向引物1和Kpms3正向引物1的5’端均为FAM荧光基团，Ktms9-1正向引物2和Kpms3正向引物2的5’端均为HEX荧光基团。

3.一种水稻光温敏雄性不育tms9-1和pms3基因的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取待检测样本的DNA；

步骤2、利用权利要求1所述的检测水稻光温敏雄性不育基因tms9-1和pms3的KASP标记引物对提取到的待检测样本的DNA进行PCR反应；

步骤3、对PCR反应产物用酶标仪进行检测，分别确定tms9-1和pms3基因的分型情况。

4.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于，所述提取待检测样本的DNA具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、取1-2cm长的水稻叶片放入2ml离心管中，放入1颗用于磨碎水稻叶片的钢珠，再加入500μl 2％的CTAB提取液，将离心管放入球磨仪后60赫兹频率振荡1min，粉碎水稻叶片，放于65℃水浴30min；

步骤1.2、加入等体积氯仿/异戊醇充分振荡，氯仿/异戊醇的体积比为24:1，放入离心机中12，000rpm离心10min，静止5min后吸取400μl上清液于1.5ml离心管；

步骤1.3、加入等体积预冷的异丙醇后上下混匀，放入离心机中12,000rpm离心5min；

步骤1.4、弃上清液并加入500μl 70％的乙醇进行洗涤；12,000rpm离心5min弃上清液后在离心管底部得到白色的DNA沉淀；

步骤1.5、室温干燥10-20min后，加入100μl去离子水溶解；

步骤1.6、待测样品的DNA，通过Replikator仪器将样本转移至孔板中，通过稀释将最终DNA浓度定为5ng/ul，采用Nanodrop One仪器确定最终DNA浓度；

步骤1.7、将装有DNA的孔板置于烘箱中烘干，65℃，处理30min，备用。

5.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于，所述CTAB提取液具体为：1mol/LTris-HCl(pH8.0)10ml；0.5mol/L EDTA(pH8.0)4ml；NaCl:8.12g；CTAB:2g，余量为水，以上体积总量为100ml。

6.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于，所述步骤2中利用权利要求1所述的检测水稻光温敏雄性不育基因tms9-1和pms3的KASP标记引物对提取到的待检测样本的DNA进行PCR反应具体为：

步骤2.1、将干燥后的孔板进行PCR体系构建，每个孔板反应仅需1ul PCR反应液；

步骤2.2、加好的反应体系的反应液进行封膜，并快速低温离心；

步骤2.3、离心后进行水浴PCR反应；

步骤2.4、PCR反应完成后，吹干降温并在酶标仪Pherastar进行读板；

步骤2.5、若没有出现清晰的分型结果，增加额外的PCR，具体步骤如下：94℃变性20Sec，57℃退火延伸60Sec，3个循环，反应结束后再行读板。