[发明专利]一种高通量检测柚皮素的方法

说明书

本发明公开了一种高通量检测柚皮素的方法。属于合成生物技术领域。本发明使用的显色剂为氢氧化钠或者氢氧化钾。经处理后，柚皮素呈现黄色，浓度越高，黄色越深，且显色越快，一般5min内反应完毕。即便在干扰物质对香豆酸存在时也可以直接用目视法选择高产菌株。该反应液也可以使用酶标仪做进一步检测。在对香豆酸存在时，建议使用KOH处理，此时柚皮素的最佳检测波长为410‑430nm。该方法简便高效，抗干扰，精准度高，成本低廉，适用于高通量筛选柚皮素高产菌株。

技术领域

本发明涉及一种高通量检测柚皮素的方法，属于合成生物技术领域。

背景技术

柚皮素是重要的黄酮类化合物合成的平台化合物，众多的黄酮类化合物都是以柚皮素为前体，经过羟基化、甲基化、异戊烯基化、糖基化等修饰后合成。而在微生物中合成柚皮素时，多使用高效液相色谱法(HPLC)作为检测手段，但在处理大量样品时，使用高效液相色谱存在明显的弊端，如通量低、时间和人力成本高等。例如一种使用HPLC检测柚皮素的方法中(参见Wu J,Du G,Zhou J,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for(2S)-pinocembrin production from glucose by a modular metabolic strategy.[J].MetabolicEngineering,2013,16(1):48-55)，使用色谱纯级别的乙腈-水作为流动相检测柚皮素，样品需要先使用0.22μm过滤预处理，每次仅能检测一个样品，每测一个样品需要运行时间17min。

在进行产柚皮素菌株的途径改造时，尤其是随机突变时，会产生数千到数亿甚至更多的突变子，仅仅依靠液相检测等手段是难以实现的。而且，在微生物发酵生产柚皮素时，会有中间产物对香豆酸产生，因此对香豆酸的存在，也可能影响到相应产物的检测。因此，提供一种快速准确的高通量检测柚皮素的方法，对于快速检测柚皮素含量和筛选柚皮素高产菌株具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明使用氢氧化钾或者氢氧化钠作为显色剂，可以和水溶液、无色合成培养基或者对应的发酵液中的柚皮素发生反应，在5min内出现明显的显色反应，根据颜色变化可以快速筛选柚皮素高产菌株。

本发明的第一个目的是提供一种高通量检测柚皮素的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向含柚皮素的待测液中添加显色剂氢氧化钾或者氢氧化钠进行显色反应，得到反应液；

(2)用酶标仪检测反应液中柚皮素的浓度；所述显色反应和酶标仪检测均是在高通量孔板上进行的。

在本发明的一种实施方式中，所述高通量孔板包含96深孔板、96浅孔板、48深孔板、 24深孔板、12深孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述含柚皮素的待测液包括的水溶液、无色的合成培养基或菌株发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述含柚皮素的无色的合成培养基包括但不限于SD，YNB， MOPS培养基。

在本发明的一种实施方式中，显色剂浓度为0.1-10M之间。

在本发明的一种实施方式中，检测体系中显色剂终浓度在0.05-9M之间。

在本发明的一种实施方式中，使用酶标仪检测反应液中柚皮素的浓度时，所用吸光值的波长范围为400-500nm之间。

在本发明的一种实施方式中，所用吸光值的波长优选410-430nm。

本发明的第二个目的是提供一种高通量筛选柚皮素高产菌株的方法，所述方法是将改造后的待筛选菌株进行发酵后，静置沉淀菌体或者离心获得发酵上清液，添加显色剂氢氧化钾或者氢氧化钠进行显色反应，得到反应液；用目视法或者酶标仪检测反应液中柚皮素的浓度。