[发明专利]一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法

权利要求书

1.一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)首先，把来自酿酒酵母的香叶基焦磷酸合成酶基因(ERG20)，设计了三个突变位点(F96W、N127W、K197G)，并人工合成出有三个点突变的ERG20基因，即ERG20^{F96W-N127W-K197G}，以下用ERG20*表示；

(2)其次，通过融合PCR方法，把基因ERG20*与来自土肉桂(Cinnamomum osmophloeum)的芳樟醇合成酶基因(LIS)进行基因融合，获得融合基因LIS-ERG20*；

(3)然后，通过人工合成的方法，合成出带线粒体定位信号肽的LIS基因即MLS-LIS，再把融合基因LIS-ERG20*和带有线粒体定位信号肽的LIS基因MLS-LIS克隆到质粒pESC-URA上，获得共表达载体(pESC-URA-LIS-ERG20*/MLS-LIS)；最后，把共表达载体转化到酿酒酵母中，即为高产芳樟醇的酿酒酵母重组菌Y_MC-01LIS-ERG20*/MLS-LIS；

(4)在酿酒酵母重组菌Y_MC-01LIS-ERG20*/MLS-LIS的摇瓶发酵培养中，优选并进一步在发酵液中添加甲羟戊酸或甲羟戊酸内酯或丙酮酸或丙酮酸盐作为碳源，进一步提高发酵液中芳樟醇含量，对发酵液进行精馏处理，即可得到纯度≥90％的芳樟醇；甲羟戊酸的含量为0-100g/L；丙酮酸的含量为0-10g/L。

2.按照权利要求1所述的一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)-(3)中所述的LIS基因序列为SEQ ID NO:1的基因编码；带有线粒体定位信号肽的LIS基因(MLS-LIS)序列为SEQ ID NO:2；ERG20*基因序列为SEQ ID NO:3。

3.按照权利要求1所述的一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，步骤(3)中的酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae BY4742-MC-01。

4.按照权利要求1所述的一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，所述质粒pESC-URA，在酿酒酵母中以游离型高拷贝质粒存在，筛选标记为URA3，即供试的酿酒酵母为尿嘧啶(URA)缺陷型，即当培养基中无URA时，则该酿酒酵母菌株不能存活生长，若能在不含URA的培养基生长的酿酒酵母菌株，即被认为是含有重组质粒的酿酒酵母。

5.按照权利要求1所述的一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，

共表达载体的构建方法，具体为：首先，根据NCBI公布的土肉桂的LIS基因和酿酒酵母ERG20基因，经密码子优化，并在ERG20基因中设计了三个突变位点F96W、N127W、K197G，在LIS基因前设计了一段线粒体定位信号肽MLS-LIS，进行人工合成获得LIS序列、ERG20*序列和MLS-LIS序列；然后，通过融合PCR技术，将LIS基因和ERG20*基因进行基因融合，获得融合基因LIS-ERG20*；最后，把融合基因LIS-ERG20*和带有定位信号肽的芳樟醇基因MLS-LIS克隆到到质粒pESC-URA，构建出共表达载体(pESC-URA-LIS-ERG20*/MLS-LIS)。

6.按照权利要求1所述的一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，步骤(4)摇瓶发酵，具体为:首先，重组菌Y_MC-01LIS-ERG20/MLS-LIS在SD-URA培养基平板培养2-3天，并挑取单菌落，于5mL的SD-URA液体培养基中，在30℃，200rpm的摇床中培养48h，即获得种子液，将该种子液以5％的接种量接种于SS-URA液体培养基中，并置于30℃，200rpm的摇床中培养72h。

7.按照权利要求1所述的一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，发酵液精馏处理具体为：取上述重组菌发酵产生的发酵液于精馏釜中，加热至液体沸腾，柱温设置86℃；塔顶温度97℃；冷凝回流装置用冷却循环水控温，设置4℃；回流比设置7﹕1，最后按时间顺序，从塔顶分阶段收集馏分。

8.按照权利要求1所述的一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，

(1)发酵培养基中所用氨基酸溶液：称量以下各种氨基酸，混合，溶于灭菌水中，使其终浓度为：L-腺嘌呤半硫酸盐(L-Adenine hemisulfate salt)200mg/L，L-精氨酸盐酸盐(L-Arginine HCl)200mg/L，L-组氨酸盐酸盐一水物(L-Histidine HCI monohydrate)200mg/L，L-异亮氨酸(L-Isoleucine)300mg/L，L-亮氨酸(L-Leucine)1000mg/L，L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine HCI)300mg/L，L-蛋氨酸(L-Methionine)200mg/L，L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)500mg/L，L-苏氨酸(L-Threonine)2000mg/L，L-色氨酸(L-Tryptophan)200mg/L，L-酪氨酸(L-Tyrosine)300mg/L，L-缬氨酸(L-Valine)1500mg/L；氨基酸母液利用0.22μm的针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱存放；

(2)把SD-URA培养基作为酿酒酵母种子培养基，SD-URA的配方(g/L)如下：葡萄糖20g，无氨基酵母氮源(YNB)1.7g，无水硫酸铵5g，第(1)步骤中所配氨基酸溶液100mL，以去离子水定容1L，混均后115℃灭菌，在制作平板时，灭菌前加入20g琼脂；

(3)把SS-URA为酿酒酵母的发酵培养基，其中SS-URA配方(g/L)：蔗糖20g，无氨基酵母氮源(YNB)1.7g，无水硫酸铵5g，第(1)步骤中所配氨基酸溶液100mL，以去离子水定容1L，混均后115℃灭菌。