[发明专利]草鱼ATG12多克隆抗体及其制备方法

权利要求书

1.草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(一)分析草鱼ATG12基因克隆及序列

1)提取草鱼肝脏总RNA

2)以步骤1)中获得的RNA为模板，反转录合成cDNA；

3)根据步骤2)中草鱼转录组测序获得的cDNA序列，设计一对引物：上游引物ATG12-MF：5＇-ATGTCTGACAACGCAGAA-3＇；下游引物ATG12-MR：5＇-TCATCCCCAGGCCTGGGA-3＇，扩增片段经回收、连接和转化，测序验证后，用Primer Premier5.0软件设计巢式引物，3＇RACE引物为RC3-1：GTCAATCAGTCATTTGCTCCATCACC；RC3-2：GTGGGTGTGCTTTTTGAGTGTTTTGG，引物的Tm64℃，3＇RACE PCR分两轮进行，5＇RACE PCR分三轮进行，5＇RACE引物为RC5-1：CCATTTTTTGGTCTTC；RC5-2：GTATCACCGACAGCCT；RC5-3：TCTTTTTCTTCTCATCCGA；而后对所得目的片段回收、连接和转化，将目的片段大小一致的阳性克隆接种于氨苄的LB液体培养液中，37℃培养过夜，吸1ml送测序，再将测序所得的序列进行拼接，再在NCBI进行BLAST，得到草鱼ATG12cDNA序列；

(二)构建ATG12/pGEX-4T-1原核表达载体

1)根据步骤(一)中获得的草鱼ATG12cDNA序列，设计一对引物：上游引物ATG12-F：5＇-GTTCCGCGTGGATCCCCGGAAATGTCTGACAACGCAGAATCTCCTA-3＇；下游引物ATG12-R：5＇-TCAGTCACGATGCGGCCGCTCTTACCCCCAGGCCTGGGACTT-3＇；以步骤(一)中合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物通过胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；

2)将步骤1)中回收的目的片段与pMD-18T载体按照摩尔比3：1用Solution I连接酶，温度16℃、连接30min，连接产物转化大肠杆菌，而后筛选阳性菌落，进行PCR与双酶切鉴定，对两次鉴定后正确的质粒进行测序，获得ATG12/pMD-18T；

3)将步骤2)中测序正确的ATG12/pMD-18T采用BamH I和EcoR I进行双酶切，切胶纯化回收目的片段，纯化的目的片段与pGEX-4T-1载体以摩尔比3：1用T4 DNA连接酶，温度16℃、连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和酶切鉴定，得ATG12/pGEX-4T-1重组质粒；

(三)ATG12融合蛋白的原核表达

将步骤(二)中重组质粒ATG12/pGEX-4T-1转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，温度37℃、220r/min振荡培养过夜；次日，按照体积1：100的比例接种至100ml新的含有氨苄青霉素培养基中，温度37℃、220r/min至OD600值为0.6-0.8时，按体积1：1000的比例加入总浓度为0.8mmol/L IPTG，温度37℃、220r/min、4h，诱导目的蛋白表达，收集诱导后含有目的蛋白表达的菌液，再在菌液中添加pH7.4、50mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬后超声破碎，得超声破碎样品，对超声破碎样品离心得上清和沉淀，将沉淀纯化后得纯化后的ATG12融合蛋白，利用His单抗与纯化后的ATG12融合蛋白进行Western blot杂交鉴定；

(四)制备ATG12多克隆抗体

将纯化后的ATG12融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，在新西兰纯种大白兔双肩周围皮下进行多点注射，注射前取少量正常血清作为阴性对照，每间隔一定时间对新西兰纯种大白兔注射免疫，合计免疫4次后，对新西兰纯种大白兔进行心脏采血，分离血清，得到ATG12多克隆抗体。