[发明专利]利用拜氏梭菌制备高酯键腐植酸制剂的方法及应用

权利要求书

1.一种高酯键腐植酸制剂的制备方法，其特征是它包括如下步骤：

（1）制作含拜氏梭菌的种子液，其中菌液浓度均为0.5×10⁸-1.0×10⁸CFU/ml；

种子培养基：牛肉膏 2 g，酵母粉 2 g，蛋白胨 6 g，CH₃COONH₄ 3 g，KH₂PO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5，121 ℃高压灭菌15min，用无菌氮气吹5 min，驱尽氧气；拜氏梭菌菌种为拜氏梭菌SE-2，拉丁文学名Clostridium beijerinckii SE-2；该菌株已于2014年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏号CCTCC No.M2014384；

（2）发酵培养基： K₂HPO₄ 0.5 g、KH₂PO₄ 0.5 g 、CH₃COONH₄ 2.2 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、MnSO₄·H₂O 0.01 g、NaCl 0.01 g、FeSO₄·7H₂O 0.01 g、硫胺维生素B1 0.001g、生物素0.00001g、p-氨基苯甲酸 0.001g，加水至1000 mL；

（3）将腐植酸钠按照4-10g/L、加入到发酵罐中；

（4）发酵罐中发酵培养基灭菌结束，降至室温后，将脂肪酶按照脂肪酶与腐植酸钠质量比为1:1-5的比例加入发酵罐；脂肪酶为诺维信公司生产的Novozym 435；

（5）将步骤（1）中获得的含拜氏梭菌的种子液与发酵培养基按照2%的体积比利用蠕动泵加入到发酵罐中，37-42℃，50-120转/分钟搅拌培养；

（6）将200g/L木糖利用蠕动泵加入到发酵罐中，维持发酵液中木糖浓度为20g/L，发酵96小时；

（7）发酵结束后通过将发酵液pH调整为2.5，促使酶促反应生成的高酯键腐植酸沉降，经板框压滤机压滤、烘干获得高酯键腐植酸制剂。

2.根据权利要求1所述的高酯键腐植酸制剂的制备方法，其特征是脂肪酶Novozym 435的酶活为10000 PLU/g。

3.一种如权利要求1所述制备方法获得的高酯键腐植酸制剂，其特征是在拜氏梭菌发酵液中按照一定比例加入腐植酸钠，发酵过程中生成的丁酸与腐植酸钠中酚羟基经脂肪酶催化形成酯键，减少发酵液中游离丁酸浓度，最终腐植酸与丁酸通过酯化反应生成成分为腐植酸丁酸酯的高酯键腐植酸制剂。

4.一种根据权利要求3所述的高酯键腐植酸制剂的应用，其特征是将高酯键腐植酸制剂以0.2%重量百分比与饲料混合，直接饲喂畜禽。