[发明专利]单体链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用

说明书

一种单体链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用，该融合蛋白包括单体链霉亲和素全长蛋白和高斯荧光素酶全长蛋白或持续发光突变体，单体链霉亲和素全长蛋白与高斯荧光素酶全长蛋白或持续发光突变体通过柔性肽连接。本发明的融合蛋白能够方便、特异性地识别生物素分子，并具有催化底物氧化发光的功能，便于检测。相比于SA和anti‑SA抗体联用检测生物素，这种融合蛋白不仅方便快速，还不会引起底物的聚集，而且只需一次表达纯化即可得到融合蛋白，生产工艺简单，有利于规模生产。该融合蛋白在DNA杂交、免疫检测、生化诊断等领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种单体链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用。

背景技术

链霉亲和素(streptavidin,SA)是Chaiet在1963年发现的，是Streptomycesavidinii菌在培养过程中分泌的产物。一条SA肽链中有159个氨基酸残基，分子量为16.5kDa。完整的SA蛋白由4条SA多肽链组成，形成一个四聚体结构。每条多肽链都可以特异性地结合一个生物素(Biotin)分子，因此，1分子SA可以结合4分子的生物素。两者之间的相互作用以非共价结合形式存在，亲和力达到10^-15/M，比抗原抗体的结合常数高若干数量级，是自然界中存在的最稳定的蛋白与小分子间相互作用。两者之间的强结合导致生物素和SA经常被用于开发标记和检测的工具。应用时通常将生物素标记于待检测的底物，用SA结合于标记在底物上的生物素，再用SA的抗体结合于SA，同时抗体上预先连接有发光基团，可被激发发光，最终通过检测发光而检测到底物。

SA和生物素之间1：4的结合比例可能引起生物素修饰的底物的聚集，在某些应用下带来不必要的副效果。因此，有研究人员将链霉亲和素和根霉亲和素(另一种与链霉亲和素结构类似，可以高效结合生物素的蛋白)的序列进行杂合，通过基因工程的手段开发出一种由一条肽链形成的单体链霉亲和素(MonoSA)，可以1：1的比例结合生物素。MonoSA对生物素仍保持了较高的结合活性，达到10^-9/M，同时避免了底物聚集带来的副作用。

荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。通常发现于低等动物体内。目前常用的荧光素酶有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶及高斯荧光素酶。萤火虫荧光素酶发光需要ATP和Mg²⁺的辅助，海肾荧光素酶虽然不依赖于ATP和Mg²⁺等辅助因子，但发光强度较弱，应用时需要更灵敏的检测。

高斯荧光素酶(gaussia luciferase,Gluc)很好地弥补了萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的缺点，发光时既不需要ATP和Mg²⁺等辅助因子，也有高于海肾荧光素酶100倍的发光效率。高斯荧光素酶是由一种海洋挠趾类动物分泌的荧光素酶，是目前发现的分子量最小的荧光素酶，并且具有信号肽，可以分泌到胞外，便于活性检测。在氧气存在的条件下，高斯荧光素酶可自发催化底物腔肠素氧化发光。发光强度是目前发现的荧光素酶中最高的，易于检测。由于以上优点，高斯荧光素酶在活细胞检测、蛋白与蛋白相互作用、蛋白定位、小干扰RNA沉默技术、高通量药物筛选等领域中得到了广泛的应用。

目前，利用MonoSA进行生物素标记的识别主要通过MonoSA和anti-MonoSA抗体的联用。即用MonoSA特异性识别生物素，然后用带有发光基团的anti-MonoSA抗体识别MonoSA，最终通过检测抗体上的发光基团的发光来检测生物素。这种方法过程繁琐，耗时长。且如果使用的是SA和anti-SA抗体还有可能造成底物聚集。

发明内容

本发明提供一种单体链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用，该融合蛋白既可以特异性结合生物素也具备高强度自发光的能力，可以方便快速的检测生物素标记的底物。