[发明专利]一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法

权利要求书

1.一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法，其特征在于，包括两个部分：标准曲线制作和样品测定；

1)标准曲线制作：标准曲线制作包括酶反应、萃取测试和线性回归三个步骤；

(1)酶反应：将TTC储备液稀释成一系列不同浓度TTC使用液，在10mL离心管中依次加入TTC使用液1mL，2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水和1mL新配的10％的Na₂S，漩涡振荡混匀后，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；

(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min^-1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1mL刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，在485nm处读取萃取液吸光度A；

(3)线性回归：以TTC浓度为横坐标，TF萃取液的A值为纵坐标作图，即得到TTC-A标准曲线，对标准曲线进行线性回归，即得标准方程：

y＝kx-b

式中，x为反应体系的TTC浓度(mg·L^-1)，y是TF萃取液的A值；

2)样品测定：样品测定包括酶反应、萃取测试和定量分析三个步骤；

(1)酶反应：在10mL离心管中依次加入1mL活性污泥样品、2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水和1mL0.4％TTC溶液；

对照组依次加入1mL活性污泥样品、2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水、0.5mL甲醛溶液后和1mL0.4％TTC溶液；

漩涡振荡混匀，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，除对照组以外，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；

(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min^-1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1mL刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，漩涡振荡一分钟，0.22μm有机滤膜过滤，在485nm处读取萃取液吸光度A；

(3)定量分析：通过标准曲线计算TF的生成量

式中，UI为TTC-比脱氢酶活性(mg TTC·g^-1·min^-1)，V为萃取剂体积(mL)，k为TTC-A标准曲线的斜率，W为污泥样品的干重(mg MLSS)，t为酶促反应时间(min)。