[发明专利]一种基于金纳米簇锚定羟基氧化钴纳米片的吡虫啉荧光免疫分析方法

说明书

本发明公开了一种基于金纳米簇锚定羟基氧化钴纳米片的吡虫啉荧光免疫分析方法，属于生物传感器技术领域，本发明通过金纳米簇锚定在二维羟基氧化钴纳米片表面，形成纳米复合材料，导致荧光强度显著降低。通过引入能够触发CoOOH纳米片分解的抗坏血酸，可有效逆转猝灭效应。值得注意的是，抗坏血酸诱导的相应荧光反应与抗体标记的ALP活性有关。经过竞争免疫反应后，ALP标记的抗体可与固定化抗原相结合，可调节检测平台的荧光变化。利用系统的荧光切换，FIA对吡虫啉的检测浓度(IC50)为1.3ng mL^‑1，比常规ELISA(86.4ng mL‑1)敏感60倍。本发明的荧光免疫分析方法能够实现靶抗原吡虫啉的高灵敏检测，不仅为农药检测开辟了新的前景，而且为荧光免疫分析开辟了有效的策略。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于金纳米簇锚定羟基氧化钴纳米片(CoOOH NPs)复合材料的制备方法，并巧妙建立碱性磷酸酶(ALP)介导的吡虫啉荧光免疫检测分析方法。

背景技术

现今，农药污染已成为一个世界性的公共卫生问题，其暴发不仅造成巨大的经济损失，还会严重危害人类生命安全。吡虫啉(Imidacloprid)作为一种触杀型烟碱类农药，作用于突触后的烟碱乙酰胆碱受体引起中枢神经正常传导受阻，使害虫麻痹死亡。同样，残留在农产品和环境样品中吡虫啉对动物和人类的神经受体也存在危害，甚者可能损害人体外周血淋巴细胞的DNA，在微量水平即可对人体健康造成巨大危险。因此，对食品和环境基质中的吡虫啉进行灵敏分析，对于满足食品安全需求、保护生态系统和保障人类健康具有重要意义。目前成熟的吡虫啉检测方法(高效液相色谱、液-质联用色谱、气相色谱法和气-质联用色谱)虽然可达到较高灵敏度，但是仪器检测存在操作复杂、成本高昂、稳定性差、检测步骤多等缺点，无法实现复杂样品中吡虫啉的大批量快速灵敏检测。基于特异性抗体-抗原识别的免疫分析，由于其操作简单、高特异性和显著选择性以及高通量等优点，成为农药检测的新策略，鉴于比色法的信号输出易于观察而被用作吡虫啉的免疫分析，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)和侧向流动免疫色谱条，以及应用辣根过氧化物酶标记的半抗原和金纳米颗粒介导的单克隆抗体作为传感器，用于扩增筛选吡虫啉的反应信号提高灵敏度。然而，传统的酶或纳米材料标记的比色ELISA法，主要缺点是检测复杂环境和食品基质中低丰度的吡虫啉时，灵敏度较低，此外，这些已建立的方法还受到具有毒性的反应底物的限制，例如邻苯二胺和(3，3’，5，5’)-四甲基联苯胺。

针对以上吡虫啉检测中的诸多问题，荧光免疫分析(FIA)利用其杰出的光学特殊荧光材料，成为一种非常有前途的候选方法。目前，荧光免疫分析大多集中于利用荧光材料作为标记产生可检测的信号，而非标记酶本身，在灵敏度方面取得显著的提高，但这类荧光免疫分析需要复杂的信号响应过程和响应机制，包括荧光各向异性/偏振测量、纳米材料-抗体结合和免疫凝集。因此，如何简化实验过程，提高传感性能，对荧光免疫分析方法的建立至关重要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有检测技术中存在的检测灵敏度低、误差较大和测试方法繁琐等问题，借助金簇纳米的强荧光性能，提供了一种基于金纳米簇(AuNCs)-锚定羟基氧化钴(CoOOH)纳米片的复合材料及其制备方法，并将其利用在吡虫啉荧光免疫检测方法中，实现复杂基质中吡虫啉的简便高灵敏检测，从而促进这类传感器在农药检测中的实用化。本发明通过将酶(碱性磷酸酶，ALP)免疫测定与荧光平台相结合，利用标记酶来触发纳米材料的荧光变化，开发直接的荧光免疫分析方法，不仅有效地提高了传感灵敏度，屏蔽了底物的毒性，而且大大简化了修饰和共轭过程。因此以荧光团和纳米材料为基础的猝灭剂在荧光免疫分析系统中的组合展现出广阔的应用前景。羟基氧化钴纳米片作为新兴的二维金属氧化物，因其具备易于快速合成、稳定性好、高亲水性等特点，在电催化和生物催化领域引起了极大关注，

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种基于金纳米簇锚定羟基氧化钴纳米片的吡虫啉荧光免疫分析方法，其步骤如下：

A、羟基氧化钴纳米片(CoOOH NPs)的制备：