[发明专利]一种血管紧张素转化酶ACE抑制肽及其制备方法

权利要求书

1.一种血管紧张素转化酶ACE抑制肽，其特征在于：其氨基酸序列为His-Leu-His-Thr。

2.一种权利要求1所述的血管紧张素转化酶ACE抑制肽的制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

S1.限进亲和介质的制备：

（1）取平均粒径为10~20 nm的Fe₃O₄分散于乙醇和水体积比为1:1的乙醇/水混合溶液中，得到Fe₃O₄的质量浓度为0.3~0.5 mg/mL的A溶液，然后按照正硅酸乙酯: A溶液为1~1.5%的体积百分比加入正硅酸乙酯，并且按照聚乙二醇单辛基苯基醚: A溶液为0.1~0.2%的体积百分比加入聚乙二醇单辛基苯基醚，并以50 kHz功率超声10 min，得到B溶液，然后按照氨水: B溶液为9~11 %的体积百分比加入浓度为25 wt%的氨水，反应2~4 h后利用外加磁场分离出固体产物得到磁性二氧化硅微球；

（2）取上述步骤（1）中制备的磁性二氧化硅微球分散于乙醇和水体积比为99:1的乙醇/水混合溶液中，得到磁性二氧化硅微球的质量浓度为1~2 mg/mL的C溶液，对C溶液进行超声分散20~30 min，再以500 r/min的转速搅拌10~15 min，然后按照3-氨丙基三乙氧基硅烷:C溶液为1~3%的体积百分比加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70~75 °C下回流8~10 h，反应结束后借助磁铁分离产物，分别用无水乙醇和水反复洗涤3~5遍，磁性分离得到氨基化微球；

（3）将上述步骤（2）中得到氨基化微球分散在摩尔浓度为0.4 mol/L的NaOH中，得到氨基化微球的质量浓度为60~80 mg/mL的D溶液，然后按照环氧氯丙烷: D溶液为50~60%的体积百分比加入环氧氯丙烷，并且按照二甲基亚砜:D溶液20~30%的体积百分比加入二甲基亚砜，在30~35 °C下摇床振荡4~6 h，然后用去离子水洗涤3~5遍得到环氧化微球，再将上述获得的环氧化微球分散于摩尔浓度为0.5 mol/L的Na₂CO₃溶液中，得到环氧化微球的质量浓度为7~8 mg/mL的E溶液，然后再按照亚氨基二乙酸: E溶液为0.01~0.03 wt%的重量百分比加入亚氨基二乙酸得到F溶液，在40~50 °C下反应6~8 h，反应结束后按照每7～8g重量的F溶液中加入1mL CuSO4溶液的比例加入摩尔浓度为0.05 mol/L的CuSO₄溶液，摇床震荡2~4 h得到亲和微球；

（4）按照每1g重量的聚乙二醇单甲醚溶于4mL二甲基亚砜的比例将聚乙二醇单甲醚溶于二甲基亚砜中得到G溶液，再按照氯仿: G溶液为30~40%的体积百分比加入氯仿及按照乙酸酐: G溶液为15~20%的体积百分比加入乙酸酐，在30~40 °C下反应10~12 h，得到醛基化改性的聚乙二醇单甲醚；将上述步骤（3）制备的的亲和微球分散于乙醇和水体积比为1:1的乙醇/水混合溶液中，得到亲和微球的质量浓度为4~6 mg/mL的H溶液，然后按照醛基化改性的聚乙二醇单甲醚: H溶液为2~4 wt%的重量百分比加入上述制备的醛基化改性的聚乙二醇单甲醚，得到I溶液，在室温下搅拌反应20~24 h后再按照NaBH₄ : I溶液为0.01~0.03 wt%的重量百分比加入NaBH₄，继续反应24~48 h，将反应后产物置于透析袋中，在蒸馏水中透析24~48 h，最后磁性分离得到磁性限进亲和介质；

S2.马氏珠母贝肉蛋白酶解超滤液的制备：

将贝肉去足丝洗净,并匀浆至糊状，将贝肉溶于去离子水中,搅拌均匀,得到贝肉的质量浓度为350~400 g/L的J溶液，煮沸10~15 min，按照碱性蛋白酶: J溶液为0.5~1 wt%的重量百分比加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为pH 9~10，温度50~60 °C，酶解2~4 h，最后加热至100 °C灭酶10~15 min，得到酶解液；将所得酶解液的上清液经0.45 μm滤膜微滤后，用截留分子量为10 kDa的超滤膜进行超滤，得到超滤液；

S3.磁性限进亲和介质分离：

将上述S1中得到的磁性限进亲和介质分散于上述S2中得到的超滤液中，得到磁性限进亲和介质的质量浓度为4~6 mg/mL的K溶液，在30~35°C下进行吸附1~2 h，然后利用外加磁场快速将介质分离，再用0.5~1 mL摩尔浓度为1~1.2mol/L的氯化铵在摇床中对介质洗脱0.5~2 h得到洗脱液，旋转蒸发洗脱液得到浓缩洗脱液；所述的氯化铵溶液中含有氯化钠，氯化钠的摩尔浓度为0.5~1 mol/L；

S4.反相柱色谱分离：

将上述S3中得到的浓缩洗脱液进行反相柱色谱分离并测定各组分的ACE抑制活性，其中对浓缩洗脱液进行反相柱色谱分离的分析条件为色谱柱：Agilent SB-C18，检测器：DAD二极管阵列检测器，流动相：A相为含有0.1%TFA的水，B相为含有0.1%TFA的乙腈；对浓缩洗脱液进行反相柱色谱分离采用两级分离程序，第一级分离程序为：0~40 min，B相乙腈体积由5%到65%，流速为0.5 mL/min，检测波长：280 nm；收集反相柱分离的各组分，测定并选出ACE抑制活性最高的两个组分F₅和F₆分别进行第二级反相柱色谱分离；组分F₅的第二级分离程序为：0~5 min，B相乙腈体积由1%到25%，流速为1 mL/min，检测波长：280 nm，收集反相柱分离的各组分，测定并选出ACE抑制活性最高的组分F₅₂；组分F₆的第二级分离程序为：0~7min，B相乙腈体积由1%到25%，流速为1 mL/min，检测波长：280 nm，收集反相柱分离的各组分，测定并选出ACE抑制活性最高的组分F₆₁；将收集到的具有最高抑制活性的组分F₅₂和F₆₁浓缩后利用基质辅助激光电离飞行时间质谱进行结构鉴定，得到氨基酸序列为His-Leu-His-Thr的血管紧张素转化酶抑制肽。

3.血管紧张素转化酶ACE抑制肽在制备减缓高血压症状的功能食品中的应用，其特征在于：所述的血管紧张素转化酶ACE抑制肽的氨基酸序列为His-Leu-His-Thr或者为Gly-Trp-Ala。