[发明专利]一种交联固定化双酶-表面活性剂复合物及其制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，提供一种交联固定化双酶‑表面活性剂复合物，通过表面活性剂对葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的双酶体系进行修饰，再经沉淀、交联等反应过程合成得到。经过表面活性剂修饰的双酶体系，大大增加了交联聚集体在反应介质中的分散性，保证其不易出现团聚现象，并具有良好的热稳定性。此外，本发明提供的交联固定化双酶‑表面活性剂复合物无需低温操作，室温下即可合成，大大降低了实验成本，使用后通过简单的离心分离可回收再利用，经过多次重复利用后酶活仍能保持较高的活力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种交联固定化双酶-表面活性剂复合物及其制备方法。

背景技术

相比于传统的化学催化剂，酶具有立体选择性好、催化速率高、反应条件温和等特点，因此在化学品制造、医药中间体合成、生物检测及食品加工等领域有着广泛的应用。但是在工业化生产中，作为催化剂的酶价格昂贵、稳定性差，无法满足重复利用的需求，已经严重限制了其发展和应用。因此，固定化技术已经成为工业化生产中的一项核心关键性技术，通过对酶进行固定化，以得到稳定性、催化性能、重复使用性能均能够达到要求的固定化酶制剂。

酶固定化方法一般分为四种：物理吸附、共价键和、包埋以及交联。常规的酶固定化手段中多涉及载体的选择，但是利用惰性的载体对酶进行固定化时，酶的负载率通常只有0.1％-10％，降低了酶催化剂的生产能力，并且也会增加酶固定化的成本。而酶的无载体交联可以在不引入惰性载体的条件下，利用双功能交联剂对酶蛋白进行直接交联，达到酶固定化的效果，其能够提高酶活保留率和催化剂中酶蛋白浓度，降低固定化成本。

专利文件CN103667219A公开了一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法，该方法在低温条件下，先将沉降剂加入到β-葡萄糖苷酶溶液中，然后加入戊二醛溶液，最后向混合液中加入还原剂，震荡后离心收集沉淀获得β-葡萄糖苷酶交联聚集体。

专利文件CN106047848A公开了一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，该方法在冰浴条件下，将卤醇脱卤酶的粗酶液中加入牛血清白蛋白形成混合液，然后加入饱和硫酸铵溶液进行沉淀分离，并加入戊二醛进行交联，通过离心处理得到卤醇脱卤酶聚集体。

上述专利利用戊二醛交联酶蛋白制备酶聚集体，都是在低温条件下先沉淀酶蛋白，增加了酶固定化的成本。固定化后得到的酶聚集体颗粒由于疏水作用容易在反应介质中发生聚集，使得交联聚集体内部的一些酶难以与底物相接触进行催化反应。而且在环境较高的反应温度中进行催化反应时，酶的催化构象会被破坏造成大量酶活的损失。

专利申请CN107988201A公开了一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备方法，包括以下步骤：获得含乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的粗酶液，加入沉淀剂混合，沉淀得到含有乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的混合物；然后加入交联剂戊二醛水溶液，最后加入吐温80，交联反应的温度是0-40℃。在该专利申请中先将酶液进行沉淀反应后进行交联反应，最后才加入表面活性剂，该方法虽然可以在0-40℃温度范围内进行共交联酶聚集体，并能在一定程度上提高共交联酶聚集体的酶活回收率(至80％)，但是对于共交联酶聚集体的热稳定性和分散性改善有限。

葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，制备的葡萄糖酸以及葡萄糖酸衍生物可以广泛应用于食品、医药、饲料以及纺织工业中。但是在葡萄糖被氧化成葡萄糖酸的过程中，会产生大量的过氧化氢，而大量的过氧化氢会严重抑制葡萄糖氧化酶的活性，抑制反应的进程。为此，可通过添加过氧化氢酶将过氧化氢降解为水和氧气，从而避免其对葡萄糖氧化酶的抑制作用，保障生产葡萄糖酸的连续顺利进行。但是通过何种制备方法制备得到一种工艺简单，活性高、分散性和稳定性好的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的共交联聚集体，克服上述现有技术的缺陷，是本发明所要解决的技术问题之一。

发明内容