[发明专利]一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法

权利要求书

1.一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用基因工程方法构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株，所述反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列来源于松针炭疽菌，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)利用所述工程菌株进行培养，并分离纯化，得到反式茴香脑加氧酶；

(3)利用反式茴香脑加氧酶催化反式茴脑的加氧反应，得到茴香醛。

2.一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用基因工程方法构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株，所述反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)利用所述工程菌株进行培养，收集菌体，用基本培养基重悬后加入反式茴香脑，培养，萃取培养液，获得茴香醛。

3.根据权利要求2所述的利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基本培养基配方为：1.2g(NH₄)₂SO₄，0.1g CaCl₂·H₂O，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.01gFeSO₄·7H₂O，0.2g K₂HPO₄，0.1g KH₂PO₄，1200mL蒸馏水；所述基本培养基重悬菌体后，加入葡萄糖使混合溶液的OD₆₀₀＝2.0，然后加入反式茴香脑在25℃、250r/min反应24小时。

4.根据权利要求1或2或3所述的利用反式茴香脑加氧酶基因合成茴香醛的方法，其特征在于，所述工程菌株为大肠杆菌菌株。

5.根据权利要求4所述的利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株的方法为：

1)将反式茴香脑加氧酶基因的核苷酸片段插入表达载体pET-41a的SpeI与XhoI位点之间，得到质粒pET41-tao；

2)将得到的pET41-tao转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中培养过夜，得到工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41-tao。

6.根据权利要求5所述的利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，所述步骤1)中，为了使基因tao的核苷酸片段置于表达载体pET-41a的SpeI与XhoI之间，在其ORF5'端前面加上序列TCAACTAGTGGTTCTGGT，在3'端后加上CTCGAGCAC，用SpeI、XhoI切割后插入表达载体pET-41a的SpeI与XhoI之间。

7.根据权利要求5所述的利用反式茴香脑加氧酶基因合成茴香醛的方法，其特征在于，所述步骤2)中通过氯化钙法将质粒pET41-tao转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。

8.根据权利要求1所述利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加氧反应在25～35℃的温度下反应0.5～1小时。

9.根据权利要求8所述利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，步骤(3)中，加氧反应在以下反应液中进行：400nmol/L反式茴香脑加氧酶，10mmol/L NADH，15μmol/L FAD，150mmol/L甲酸钠，0.5U甲酸脱氢酶，20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L反式茴香脑。

10.根据权利要求9所述利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。