[发明专利]一种诱导海洋放线菌沉默基因表达产生新物质的方法

说明书

本发明属于基因诱导技术领域，公开了一种诱导海洋放线菌沉默基因表达产生新物质的方法；以无菌陈海水冲洗紫海胆，用无菌水洗3遍后取其肠道组织置于无菌水中，稀释，吸取200μL，涂布在含有50μg/mL重铬酸钾和20μg/mL卡那霉素的高氏培养基平板上，得到放线菌菌株；对菌株进行小规模发酵，采用平板滤纸片法筛选出2株菌株发酵液的乙酸乙酯粗提物，并进行活性筛选；检测诱导后的菌株产生新次级代谢产物。本发明首次采用物理与化学方法来诱导海洋放线菌沉默基因表达产生新物质，并利用谱学测试和活性评价相结合建立诱导和识别海洋放线菌产新物质的方法。

技术领域

本发明属于基因诱导技术领域，尤其涉及一种诱导海洋放线菌沉默基因表达产生新物质的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：微生物产生的活性物质中超过50％来自于放线菌，由于放线菌在产生新型活性代谢产物方面的能力非常突出，在过去的50年里科学家们一直致力于从陆栖微生物源中分离新型放线菌。然而，近年来从陆栖放线菌中分离得到的新型化合物的数量在持续减少，因此人们需要从未开发的放线菌栖息地中寻找新型的放线菌，作为开发新型活性次级代谢产物的来源。由于海洋环境的特殊性，海洋放线菌在生理生化特性和遗传背景特性上与陆生放线菌存在差异，使得海洋放线菌能够产生结构新颖的活性代谢产物。海洋放线菌分布于不同的海洋环境和栖息地，已有大量研究证明可以在海洋的任何地方找到新颖的放线菌，包括从深海海底到珊瑚礁、从海底沉积物到海洋无脊椎动物和植物、从海洋的表面到海底深渊都可发现海洋放线菌的踪迹。

近年来，专性海洋放线菌Salinispora属菌株被报道能产生多种结构多样的次级代谢物，该属放线菌被证明是新化学结构物质丰富的来源，包括潜在的蛋白酶抑制剂salinosporamideA，新萜类化合物，氨基酸衍生物，以及多烯大环内酯类。

海洋放线菌在水产养殖中具有重要的应用价值，已有研究海洋放线菌应用于水产养殖致病菌引起病害的预防。现有技术一报道了利用海洋放线菌治疗和预防致病性弧菌引起的虾病害，能够抑制弧菌菌膜的形成，其在养殖池塘水系中产抗菌类物质。现有技术二报道了海洋链霉菌作为益生菌应用于促进斑节对虾的生长。现有技术三研究人员从海洋放线菌中提取抗菌物质，并将其与食物一同喂养凡纳滨对虾，对具白点综合症病毒的对虾产生抗病毒效应。

近年来海水养殖业发展迅猛，许多水产养殖病害严重且难以控制，而从海洋生物及其共生微生物中寻找新型药物分子地研究发展迅速，已有研究将海洋微生物应用于水产养殖致病菌引起病害的预防，可能是其产生活性分子的作用，这为海水水产养殖病害控制提供了很好的研究方向。同时，微生物具有生长繁殖快、易于培养的优点，可通过育种、培养条件控制等技术来提高其有效成分的含量，并可利用发酵工程来实现工业化大规模生产，从而从根本上解决原材料短缺的问题。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)野生放线菌菌株发酵产生的活性成分产量往往较低，有时即使可以分离得到新化合物，但因为量太少而不足以完成其活性鉴定等方面的工作。

(2)在常规培养条件下放线菌中的许多次级代谢途径是沉默的，所以较难发现其产新活性物质的能力，从而在源头上限制了原创新药先导化合物的发现。

解决上述技术问题的难度和意义：

从海洋生物及其共生微生物中寻找新型药物分子，可以对水产养殖致病菌引起的病害进行防治。

微生物具有生长繁殖快、易于培养的优点，可通过育种、培养条件控制等技术来提高其有效成分的含量，并可利用发酵工程来实现工业化大规模生产，从而从根本上解决原材料短缺的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种诱导海洋放线菌沉默基因表达产生新物质的方法。

本发明是这样实现的，一种诱导海洋放线菌沉默基因表达产生新物质的方法为：