[发明专利]一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用

说明书

本发明提供了一种靶向PRIM1基因的干扰RNA、慢病毒载体及其应用，所述RNA干扰序列能够抑制肿瘤细胞的生长，由其构建的的慢病毒载体能够抑制PRIM1基因在mRNA水平的表达，可以用于制备抗肿瘤药物，为后续深入研究PRIM1基因在肿瘤形成中具体的作用机制提供了一种切实有用的方法。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用。

背景技术

随着人类生活习惯和行为模式的改变，以及工农业发展过程带来的环境污染和人口老龄化等原因，恶性肿瘤成为人类致死是主要疾病。世界卫生组织国际癌症中心的最新数据显示恶性肿瘤在全球的发病率呈上升趋势，其中64％发生在发展中国家。在我国，肿瘤防治面临的形式也极为严峻，最新报告显示，在过去30年间，我国恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈明显上升趋势。因此，对肿瘤的研究是生命科学和医学领域的持续研究热点之一。近年来发展了许多针对肿瘤的基因治疗方法的研究，但迄今为止进入临床应用的几种基因药物的临床疗效有限，且具有潜在的、长期的、延迟的副作用，因此，寻求治疗的新靶点已成为国内外肿瘤基因治疗的研究方向。

肿瘤细胞的DNA启动点的研究是目前肿瘤研究的热点区域，DNA合成酶主要作用是开始细胞(包括肿瘤细胞)DNA的合成。真核细胞核DNA引物合成酶含有两个亚基，及PRIM1和PRIM2。PRIM1是异四倍体真核生物多醚菌素α引物酶合成物最小亚基，其单独携带有酶的催化作用和引物的延伸作用，然而PRIM2没有这些酶的活性作用。在整个细胞周期，PRIM1基因的mRNA的表达水平是随着催化的进程不断调整的，没有PRIM1的催化作用，DNA的复制是无法进行的，PRIM1基因突变影响细胞循环周期G1到S期过渡，所以PRIM1基因在细胞(包括肿瘤细胞)的整个形成过程中扮演非常重要的角色。目前已有PRIM1基因在膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤细胞中的报道，但至今尚未有PRIM1基因在肿瘤形成中具体作用机制的报道，本实验以PRIM1基因为模板，构建其RNA干扰慢病毒载体，供后续深入研究PRIM1基因在肿瘤行程中具体的作用机制。

慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1来源的一种慢病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染和稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体包装系统主要的组成部分。携带有外源性基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、包装细胞系的辅助下，经过慢病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在体细胞或活体组织中长久的表达。载体构建的原理是将病理基因组中的顺式作用元件与编码反式蛋白的序列进行分离，慢病毒载体中除了留下必须的反式作用元件和包装信号，其余病毒序列均被外源基因替代。慢病毒载体广泛用于基础研究与临床研究，已经成为真核系统基于转移的有力工具，常用于人类疾病的基因治疗、癌变模型等研究。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种靶向PRIM1基因的干扰RNA序列，其核苷酸序列如下：

正义链：

5’-CCGGGCCCTTGTTCCTGAAACAATTCTCGAGAATTGTTTCAGGAACAAGGGCTTTTTG-3’，即SEQ ID NO.5；

反义链：

5’-AATTCAAAAAGCCCTTGTTCCTGAAACAATTCTCGAGAATTGTTTCAGGAACAAGGGC-3’，SEQID NO.6。

本发明还包括一种含有权利要求1所述RNA干扰序列的慢病毒表达载体。

进一步地，所述慢病毒载体由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6退火形成双链，然后经AgeI和EcoRI酶切位点连入GV115慢病毒表达质粒而得。