[发明专利]一种DNA聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用

权利要求书

1.一种DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种重组载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1中所述的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还含有T7启动子、lac操纵子。

4.一种DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计得到如权利要求1中所述的编码所述DNA聚合酶的核苷酸序列，并合成DNA分子；

(2)取步骤(1)得到的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；

(3)取步骤(2)得到的重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；

(4)扩大培养步骤(3)中得到的转化体，诱导表达，收集表达产物；

(5)纯化步骤(4)中得到的表达产物，获得该高保真DNA聚合酶。

5.根据权利要求4所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的核苷酸序列设计方法包括：①获得Pfu DNA聚合酶的cDNA序列和Sso7d序列；②对Pfu DNA聚合酶的cDNA序列进行碱基优化，再进行密码子偏好性优化；③对Sso7d序列进行碱基优化；④将②、③优化得到的序列组成融合序列。

6.根据权利要求5所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述步骤②中对Pfu DNA聚合酶的cDNA序列进行的碱基优化实现：原pfu蛋白序列的第54号氨基酸由异亮氨酸I变成亮氨酸L、第72号氨基酸由谷氨酸E变成谷氨酰胺Q、第157号氨基酸异亮氨酸I删除、第176号氨基酸由异亮氨酸I变成谷氨酸E、第177号氨基酸由天冬氨酸D变成丝氨酸S。

7.根据权利要求5所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述步骤②对Pfu DNA聚合酶的cDNA序列进行密码子偏好性优化的原则包括：

A、同一氨基酸选择大肠杆菌使用频率较高的密码子，若某种氨基酸有多个密码子且使用频率相同，多种密码子尽量均匀分布；

B、避免Xho I、Bgl II、Sal I、Xba I酶切位点；

C、避免序列出现6个以上连续碱基。

8.根据权利要求5所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述步骤③对Sso7d序列进行碱基优化实现：原Sso7d蛋白序列的第11号氨基酸由谷氨酸E变成谷氨酰胺Q、第38号氨基酸由甘氨酸G变成丝氨酸S。

9.根据权利要求4所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)所用到的宿主细胞为大肠杆菌。

10.权利要求1所述DNA聚合酶、权利要求2或3所述的重组载体或权利要求4-9任意一项所述的制备方法所制得的DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。