[发明专利]一种靶向结合CD133蛋白的核酸适配体药物偶联物及其用途

说明书

本发明提供了一种靶向结合CD133蛋白的核酸适配体药物偶联物及其用途，核酸适配体序列如SEQ ID NO.1，本发明采用细胞筛选的方法从ssDNA文库中筛选出靶向结合CD133蛋白的适配体，挑选出本发明的适配体AP‑1‑M。在本发明的其中一种方案中最后利用物理镶嵌的方式将经典化疗药物阿霉素(DOX)和AP‑1‑M连接，获得能靶向结合ATC的核酸适配体‑细胞毒偶联物(AP‑1‑M‑Dox)并探究其细胞毒性作用，为临床上筛选和研究新型靶向药物提供了较好的靶标，也为临床治疗ATC提供了新的方法和思路。

技术领域

本发明属于生物制药领域，特别涉及一种靶向结合CD133蛋白的核酸适配体-细胞毒偶联物。

背景技术

CD133蛋白为细胞膜蛋白超家族成员，含有865个氨基酸、分子量约为120kDa的糖蛋白，其分子结构包括：细胞外N-端，2个细胞外Loop环，5次跨膜结构域，一个59个氨基酸的细胞C-端和8个N-糖基化端。CD133蛋白的预测大小为97kDa，但实际的糖基化CD133的分子量为120kDa。近年来，研究者发现CD133蛋白存在于多种干细胞样的肿瘤细胞表面，其中包括肝癌、结肠癌以及卵巢癌，这为临床上筛选和研究新型药物提供了较好的特异性靶点，从而为研发更加安全有效的分子靶向药物提供了的思路。此外，也有研究报道CD133蛋白在未分化型甲状腺癌(Anaplastic thyroid carcinoma，ATC)中有表达，这提示了膜蛋白CD133有望作为适配体的结合靶点之一用于ATC的靶向治疗。

核酸适配体，又称化学抗体，具有精准的靶向性，由单链的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸构成。虽然多数核酸适配体本身没有治疗作用，但核酸适配体可以与毒性药物相连接组成靶向适配体偶联物，可以将药物“精确”地运送到靶细胞，使得适配体偶联药物被靶细胞内吞，在细胞内部释放药物诱导凋亡，既有效地提高了肿瘤局部的药物浓度，又可极大地降低体内其它组织、器官的毒性，从而达到真正靶向增效减毒的作用。此外，核酸适配体还具有以下优势：1.体外筛选，可快速人工合成；2.靶标类型广泛，蛋白质或完整细胞等均可作为筛选靶标；3.分子量不大，不发生免疫反应，易与靶分子特异性结合，亲和力强，且解离常数可以达到pmol至nmol；4.化学稳定性好，变性与复性可逆，易于室温运输和长期保存等。

甲状腺癌根据病理分型可分为乳头状癌，滤泡状癌，Hurthle Cell癌，髓样癌和未分化癌，其中未分化型甲状腺癌(Anaplastic thyroid cancer，ATC)是一种高度恶性肿瘤，预后极差，中位生存期约3-7个月，一年生存率约10％。虽然ATC仅占甲状腺恶性肿瘤的2％，但由于我国的甲状腺癌患者数量庞大，因此ATC患者的绝对数量并不低。此外，因ATC导致死亡的患者约占甲状腺肿瘤死亡总人数的14％-39％，是人类最致命的恶性肿瘤之一，而且手术、放疗、131I等传统治疗手段对ATC几乎无效。因此如何提高和改善此类患者的治疗效果，延长患者的中位生存期，一直以来是ATC研究上的难点及热点。

目前，核酸适配体偶联药物作为大分子靶向治疗恶性肿瘤的主要研究方向之一，近年来逐渐成为研究的热点。然而针对甲状腺癌的核酸适配体及其细胞毒偶联物的相关研究较少，尤其是和ATC相关的核酸适配体及细胞毒偶联物的研究尚未见报道。

发明内容

本发明利用RT-PCR、免疫印迹法和激光共聚焦显微镜(Confocal Microscopy)等方法确证了CD133蛋白在未分化型甲状腺癌细胞有表达且表达于细胞膜上，而正常甲状腺细胞不表达CD133蛋白，这提示膜蛋白CD133可以作为ATC的结合靶点之一。

随后发明人采用细胞筛选的方法从ssDNA文库中筛选出靶向结合CD133蛋白的适配体，并对筛选出的ssDNA通过高通量测序的方法进行检测，最终通过流式细胞术等方法对所得序列的稳定性以及亲和性的分析，挑选出适配体AP-1-M即本发明的适配体。然后通过免疫荧光法证明适配体AP-1-M能够特异性地靶向结合CD133蛋白，并和表达CD133蛋白的ATC细胞结合从而起到靶向输送的作用。