[发明专利]基于N-烷基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法

权利要求书

1.基于N-烷基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）氨基代谢物标准溶液的配制：取氨基代谢物，用体积比50-70%的甲醇水溶液配制成浓度为10-600μM的标准溶液；

（2）氨基代谢物的衍生化反应：在含N-乙基马来酰亚胺（NEM）的磷酸缓冲液中，加入氨基代谢物标准溶液，20-30℃反应1-20min；然后加入4-叔丁基苯硫酚（tBBT），20-30℃反应至少2 min，再加入含三(2-羧乙基)膦（TCEP）和抗坏血酸（Vc）的醋酸缓冲液，涡旋混匀至少10min；再加入NaBH₃CN或者NaBD₃CN，涡旋混匀；再加入醛溶液，25-37℃反应12-24h；然后用盐酸调节反应液pH至2-3，淬灭反应，稀释后加入内标；

（3）烷基化氨基代谢物的检测：采用UHPLC-MS/MS进行测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氨基代谢物包括：亮氨酸、甘氨酸、半胱氨酸这些必需氨基酸，以及S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷高半胱氨酸这些含腺苷类氨基代谢物，组氨酸，多巴胺这些神经递质，以及其他类别的氨基代谢物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，衍生化反应采用不含稳定同位素标记的NaBH₃CN对代谢物进行衍生化处理，得到不带标记的衍生物，称为轻标；而采用稳定同位素标记试剂NaBD₃CN对代谢物进行衍生化处理，得到含氘标记的衍生物，称为重标，重标可作为内标用于定量分析。

4. 根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，反应体系中，NEM的浓度为2-5倍氨基代谢物浓度；磷酸缓冲液浓度为0.1-0.3 M，pH为7-8。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，tBBT的浓度为5-10倍NEM浓度， TCEP浓度为5-20倍氨基代谢物浓度，Vc浓度为5-20倍氨基代谢物浓度；反应液中浓度为0.1-0.5M，pH为5-7。

6.根据权利要求1、2、3或5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，NaBH₃CN或者NaBD₃CN的浓度为100-200倍氨基代谢物浓度；所述的醛为乙醛、丙醛、丁醛、戊醛或己醛，其浓度为250-500倍氨基代谢物浓度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，测定条件为：

a、色谱条件：使用UHPLC系统，采用C18反相色谱柱；流动相A配置为含有0.05-0.1%甲酸的双蒸水，流动相B为含有0.05-0.1%甲酸的乙腈；流速设为0.400-0.600 mL/min，进样量设为0.2-5.0 μL，柱温设为35-45℃；

b、质谱条件：使用QqQ MS 系统，采用ESI离子源，干燥气温度：150-290℃，干燥气流量：10-20 L/min，雾化器压力：40-60 psi，鞘气温度：250-400℃，鞘气流量：5-12L/min，毛细管电压：3500-4000 V，喷嘴电压：400-600 V；数据采集使用正离子、DMRM模式，采样前0.5 min进废液瓶。