[发明专利]一种热启动Taq DNA聚合酶组合优化分子试剂的方法

说明书

本发明公开了一种热启动Taq DNA聚合酶组合优化分子试剂的方法。具体而言，本发明涉及一种针对不同分子试剂应用的热启动Taq DNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，根据不同的分子试剂应用特点，将不同类型不同封闭程度的Taq DNA聚合酶进行有针对性的组合，发挥不同种类Taq DNA聚合酶的优势以适应不同的应用需求。本发明针对不同的应用需求，发挥不同热启动技术的优势相互取长补短。为反应体系的优化提供一种全新的思路。

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种针对不同分子试剂应用的热启动TaqDNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，根据不同的分子试剂应用特点，将不同类型不同封闭程度的Taq DNA聚合酶进行有针对性的组合，发挥不同种类Taq DNA聚合酶的优势以适应不同的应用需求。

背景技术

聚合酶链式反应技术(PCR反应)是现代生物技术的核心技术之一，该技术的原理为利用Taq DNA聚合酶在体外利用与目的模板特异结合的上下游引物，通过95℃变性、60℃退火、72℃延伸三个步骤经过25-40个循环达到对目的基因片段的大量扩增。该技术经过近40年的发展，已经广泛的应用与生物科学科研和医学检测中。

随着检测技术的发展和需求的提高。PCR技术已经由之前的定性分析发展到了定量分析。通过实时荧光定量技术，检测人员可以实现对样品中的较低的病毒数量进行检测分析，为医生提供更为早期的诊断依据。

而传统的Taq DNA聚合酶由于其在常温下具备一定的活性，从而容易造成引物二聚体和非特异扩增，进而造成检测结果的偏离甚至产生假阳性的结果。针对这一应用需求开发的热启动技术的核心在于抑制Taq DNA聚合酶常温下的活性反应。目前常见的热启动技术分为：1石蜡包埋法；2抗体抑制法；3化学修饰法等。

1.石蜡包埋法的原理是将Taq DNA聚合酶包埋于石蜡小球中，常温下酶同反应体系隔绝，加热后石蜡融化后释放酶参加反应。但石蜡球制备复杂，且石蜡对于荧光读取有一定干扰，使用受到很大限制。

2.抗体抑制法使用传统单克隆抗体，低温抗体同酶结合抑制活性，高温抗体失活释放活性。本方法为目前主流方法之一。但抗体抑制法的问题在于：a传统的单克隆制备方式无法在制备阶段特异性的针对酶的活性位点进行制备，所以对于酶的抑制效果有限既对于扩增反应中无模板对照组(NTC)的抑制效果有限，无法满足高特异性应用的需求。b单克隆抗体制备成本较高。抗体抑制法出现的早期，人们首先想到使用多克隆抗体，多克隆抗体针对多个抗原决定簇，理论上是可以封闭所有位点的。但在实际操作过程中，往往因为可以结合的表位过多，当一些非活性表位上结合了相应的抗体后由于竞争抑制效应活性位点反而无法封闭。而且由于多克隆抗体生产的过程无法精准的实现控制，每个批次产生的针对各个表位的抗体的比例均不相同所以该方法无法实现标准化和重复性制备，已经被大家放弃。但本专利中首创将多克隆抗体作为辅助抑制剂使用辅助单克隆抗体无法封闭的位点。同时当PCR反应第一步预变性94℃ 2min时封闭剂均解离，酶活释放参与反应。多克隆抗体同时也能起到一定的提高酶稳定性的作用。

3.化学修饰法使用生化试剂对特定氨基酸进行修饰，进而达到抑制活性的作用。化学修饰法成本较抗体抑制法低，也是主流热封闭技术之一。但化学封闭技术容易造成TaqDNA聚合酶结构的不可逆损伤，进而影响活化后酶的灵敏度，不适用于一些对检测灵敏度高的应用。而且由于化学修饰的自身的稳定性，打开化学键释放酶活性的过程需要大量的能量，体现在反应中则需要95℃更长的时间，以ABI公司的金牌热启动Taq酶来说激活过程长达10-15min。大大增加了反应时间增加了反应的不确定性。

4.使用多肽片段进行封闭的热启动技术是近年来才发展起来的技术，其特点是利用噬菌体肽库筛选出的阳性系列配体本身基于用于药用靶向抗体筛选的单链抗体技术，优势如下：1以亲和力为指标，保证了同靶分子的结合效果；2配体序列可知，可以通过信息学分析比对选择最佳结合位点；3可以利用分子生物学和蛋白质工程技术实现该配体的高效、规模化、低成本的体外标准化制备，从而省略昂贵的细胞培养过程。