[发明专利]BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物及其筛选方法

权利要求书

1.BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述BRAF抑制剂通过抑制细胞发生坏死来实现。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述BRAF抑制剂靶向抑制细胞发生坏死。

4.根据权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于，所述BRAF抑制剂为药物活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。

5.权利要求1～4任一项所述用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物BRAF抑制剂的筛选方法，其特征在于，将坏死通路敏感细胞系L929-FADD基因敲除细胞株作为细胞增殖和坏死的模式细胞，从FDA药物库若干小分子化合物中筛选影响抑制细胞死亡的小分子化合物，再对筛选所得的小分子化合物进行不同药物浓度的检测，明确其毒性-效应浓度，并从毒性和恢复效率综合评估得到BRAF抑制剂，其通过抑制细胞发生坏死用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物；所述BRAF抑制剂的筛选方法包括以下步骤：

(1)所述坏死通路敏感细胞系L929-FADD基因敲除细胞株复苏、培养与冻存，和

(2)所述FDA药物库的若干小分子化合物定量，且以Nec-1作为阳性对照，和

(3)构建用于制备治疗程序性坏死疾病药物的小分子化合物筛选的细胞模型，和

(4)检测步骤(3)中所述细胞模型的细胞存活率，并筛选所述小分子化合物，和

(5)蛋白免疫沉淀检验验证步骤(4)中所述小分子化合物在坏死信号通路上的表达。

6.根据权利要求5所述BRAF抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：于液氮中取出冻存的L929细胞和L929-FADD-KO细胞，迅速置于37℃水浴，不断晃动细胞快速融解，然后将所述的L929细胞和L929-FADD-KO细胞分别转入培养皿中加入培养基进行培养过夜，细胞贴壁后换液继续培养，待细胞生长至90％密度时传代；其中，

所述L929细胞的培养基为含10％FBS的高糖DMEM培养基，于5％CO₂、37℃和饱和湿度条件下培养；

所述L929-FADD-KO细胞的培养基为含10％FBS的高糖DMEM培养基且加入0.05μL/mLpruo和0.33μL/mL Nec-1，于5％CO₂、37℃和饱和湿度条件下培养；

再选生长状态好、生长旺盛的细胞用PBS洗两次后，用胰酶消化至细胞变圆，用RPMI-1640培养基终止反应，800rpf离心5分钟后弃上清，加入冻存液，将细胞分装于冻存管中，放入程序降温盒中保存于-80℃超低温冰箱中，24小时后转移至液氮中；其中，

所述RPMI-1640培养基内含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素，终止反应条件为：95％空气、5％二氧化碳、37℃；

所述冻存液的成分为：10％DMSO和90％小牛血清。

7.根据权利要求5所述BRAF抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述小分子化合物定量为：每管100μL，浓度为10mM，使用浓度为30μM，所述Nec-1的使用浓度为30μM作为阳性对照。