[发明专利]一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用

权利要求书

1.一种在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过向载体中插入芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotB-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotC-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotE-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotG-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotX-god基因片段，构建重组载体，然后转化枯草芽孢杆菌制得；

所述cotB-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述cotC-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述cotE-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述cotG-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述cotX-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述载体为整合型载体pDG1730。

3.权利要求1所述在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列；

所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotC-F：aaaactggtctgatcggatccGCAAAGAAGACAAACAAATGTAGGA；

cotC-R：GGGAACTTCATGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTC；

所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotG-F：ggatgctggtaatgcttagTTTTTAAAACCGCGCGTACTATG；

cotG-R：ACTTCATTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG；

所述CotX蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotX-F：gatgctggtaatgcttagCCAATCATAAAAAATAGGGTTCTTCA；

cotX-R：GATTGGGAACTTCATGAGGACAAGAGTGATAACTAGG；

所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotE-F：gctggtaatgcttaggctagcGAACTAAATAATCTATGTACCAAATGTTCAA；

cotE-R：GGAACTTCATTTCTTCAGGATCTCCCACTAAAAACTC；

所述CotB蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotB-F：gctggtaatgcttagATGCGTGAAAATGGGTATTCG；

cotB-R：GAACTTCATAAATTTACGTTTCCAGTGATAG；

以黑曲霉Aspergillus niger为模板分别扩增与芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白重叠的葡萄糖氧化酶的基因序列；

与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotc-god-F：AAAGCATAAAAAACACTACATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotc-god-R：aCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotG-god-F：CAAAAAGAAATACAAAATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotG-god-R：ggCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

与CotX蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotX-god-F：GTTATCACTCTTGTCCTCATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotX-god-R：tgcaggaattcgataagcttGCGGCCGCTTTAGGCTAGCCTAAGCATTACCAGCAT

CCTTAATAAC；

与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotE-god-F：GGAGATCCTGAAGAAATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotE-god-R：cgcatCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

与CotB蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotB-god-F：TATCACTGGAAACGTAAATTTATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotB-god-R：gaattcgataagcttgcggccgcCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

（2）分别采用重叠PCR将步骤（1）制得的孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列与其对应的葡萄糖氧化酶基因片段god分别融合，制得cotC-god、cotG-god、cotX-god、cotE-god和cotB-god融合基因片段；

（3）将整合型质粒pDG1730经BamHI和HindIII双酶切后，同时与步骤（2）中制得的cotC-god、cotG-god、cotX-god三种融合基因进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg；

（4）将步骤（3）中制得的重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg经NheI和NotI双酶切后，与步骤（2）中制得的cotE-god和cotB-god两种融合基因进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg；

（5）将步骤（4）得到的重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg电转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选，获得重组枯草芽孢杆菌pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg。