[发明专利]一种人巨细胞病毒检测试纸及其制造方法

权利要求书

1.一种人巨细胞病毒检测试纸，包括：承载基板(1)和试纸；所述的试纸由样品垫(2)、胶体金结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸样垫(5)组成；其特征在于：所述的样品垫(2)粘贴于所述的承载基板(1)的一端，所述的样品垫(2)的一端紧密压接所述的胶体金结合垫(3)，所述的胶体金结合垫(3)的另一端紧密压接所述的硝酸纤维素膜(4)，所述的硝酸纤维素膜(4)的另一端连接所述的吸样垫(5)；所述的硝酸纤维素膜(4)包被有相互分离的检测T线(41)和质控C线(42)，所述的检测T线(41)为SPA(葡萄球菌A蛋白)，所述的质控C线(42)为人巨细胞病毒pp150或gB或pp65抗体；所述的胶体金结合垫(3)内含有标记人巨细胞病毒特异性的抗原pp150-gB-pp65融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒检测试纸，其特征在于：所述的样品垫(2)为玻璃纤维膜或无纺布，所述的吸样垫(5)由吸水滤纸构成。

3.根据权利要求2所述的人巨细胞病毒检测试纸，其特征在于：可用pp28(UL99)或gH(gpUL75)替代pp150-gB-pp65融合蛋白中的一种。

4.根据权利要求2所述的人巨细胞病毒检测试纸，其特征在于：可在pp150-gB-pp65融合蛋白中增加pp28(UL99)和gH(gpUL75)的一种或两种。

5.根据权利要求3或4所述的人巨细胞病毒检测试纸，其特征在于：可将人为提纯出的人巨细胞病毒抗体加入胶体金结合垫(3)中，来结合人血液中的病毒抗原。

6.一种如权利要求1-5所述的人巨细胞病毒检测试纸的制造方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)重组基因构建及融合蛋白分离提取，①聚合酶链反应引物，根据目的片段的DNA序列，设计三对引物(P1，P2)，(P3，P4)和(P5，P6)，P1和P2用于扩增pp150基因片段，P3和P4用于扩增gB基因片段,P5和P6用于扩增pp65基因片段,P1和P6引物带有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，P2和P3、P4和P5引物的顺序互补，P2、P3共同对应于pp150上述片段的3’末端和gB上述片段的5’末端序列,P4、P5共同对应于gB上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列；

②目的基因的克隆，取病毒培养液1μl，加入10×Pfu高保真酶缓冲液5μl，浓度2mmol/LdNTPS 5μl，P1、P2引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加灭菌双蒸水至50μl并充分混匀；反应条件为变性94℃30s，退火65℃30s，复性72℃60s，进行30个循环，再72℃延伸10min；P3、P4和P5、P6引物克隆方法同上；然后以第一轮PCR扩增得到的pp150片段、gB(UL55)为模板，加入引物P1和P4，扩增pp150-gB片段，反应条件为pp150片段、gB分别为1μl，加入10×Pfu高保真酶缓冲液5μl，浓度2mmol/L的dNTPS5μl，P1、P4引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加灭菌双蒸水至50μl，充分混匀，反应条件为变性94℃30s，退火65℃30s，复性72℃90s，进行30个循环，再72℃延伸10min，得到串联的目的基因重组片段pp150-gB；之后以第一、二轮PCR扩增得到的pp150-gB片段、pp65片段为模板，加入引物P1和P6，扩增pp150-gB-pp65片段，反应条件同上，得到串联的目的基因重组片段pp150-gB-pp65；

③pET28a-pp150-gB-pp65重组质粒的构建与鉴定，将纯化的PCR产物pp150-gB-pp65用NdeI和Xhol酶切，并与经过同样处理的pET28a原核表达载体连接，转化到大肠杆菌TOP10中，抽取质粒DNA,进行酶切鉴定，并转化到大肠杆菌BL21中；

④pET28a-pp150-gB-pp65融合蛋白的诱导表达，将含pET28a-pp150-gB-pp65重组质粒的BL21菌液以1:100的比例加入到L.B培养液中，37℃振荡培养2小时后加入IPTG至终浓度为1mmol/I，37℃诱导3小时后离心收集菌体，重悬于2X样品缓冲液中,100℃煮沸，进行SDS-PAGE电泳分析；

⑤表达蛋白的纯化，取诱导后的菌体培养液离心收集菌体,经超声破碎后利用Ni蛋白纯化柱进行纯化，分别收集洗脱峰蛋白，并进行SDS-PAGE凝胶电泳分析；

⑥重组蛋白的抗原性分析，将重组的菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，切胶进行蛋白质电转移,将目的蛋白电转至PVDF膜上，用含质量浓度50g/L脱脂奶的PBS封闭PVDF膜,4℃过夜,PBS洗膜3次，以封闭液1:20稀释阳性血清，与PVDF膜于37℃共同孵育2h后，用PBS洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，37℃孵育1h,PBS洗膜后TMB显色，至目的条带显色清晰时终止反应；

(2)胶体金结合垫的制造，以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内,用0.2MK2CO3调至pH8.0,按100ml胶体金溶液加入0.5-2mg人巨细胞病毒pp150-gB-pp65抗原，室温搅拌2小时，加入1％牛血清白蛋白BSA,1％聚乙二醇PEG20000封闭20min,12000r/m离心30分钟,弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml,按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间，温度20-25℃,湿度小于30％，干燥2-5小时，制成胶体金结合垫；

(3)硝酸纤维素膜的检测T线和质控C线制造，以0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将SPA(葡萄球菌A蛋白)配制成1-2mg/ml的溶液,用喷膜仪在硝酸纤维素膜下部以1-1.5μl/cm的参数进行划线，包被检测T线，同时在硝酸纤维素膜上部包被pp150-gB-pp65融合蛋白IgG、IgM抗体作为质控C线，划线后将硝酸纤维素膜在干燥温度20-25℃,湿度小于30％,干燥2-5小时；

(4)检测试纸的装配，在干燥室内，温度20-25℃,湿度小于40％,取承载基板，将已包被的硝酸纤维素膜放置在承载基板的中部粘贴，在硝酸纤维素膜的检测T线侧搭接胶体金结合垫的1/3处粘贴，在胶体金结合垫另一侧搭接粘贴样品垫，搭胶体金结合垫的1/5；在硝酸纤维素膜质控C线一侧搭接吸样垫,搭吸样垫的1/10；最后形成检测试纸。