[发明专利]一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：经过illumina测序平台专用测序接头连接反应制备的DNA文库采用杂交探针捕获的方法获得目标区域文库，采用LMPCR方法扩增文库，再进行文库纯化，即得测序基因检测文库，所述的目标区域DNA为ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1基因的突变及以上基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域。

2.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)DNA质量标准：提供受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质检后，要求DNA符合一定质控标准；

(2)文库制备：将上述复合标准的基因组DNA，超声随机打断至180bp-220bp短片段，然后进行末端补平加A,连接illumina测序平台专用测序接头，并通过PCR扩增达到一定总量的DNA文库；

(3)杂交捕获：将步骤2得到的文库，与疾病相关定制探针进行特异性杂交，捕获含目的区域的文库，再通过磁珠抓取、富集留下含目的区域的DNA文库，即得目标区域文库；

(4)LMPCR扩增：将步骤3得到的目标区域文库，作为LMPCR模板，加入与测序接头匹配的引物及相应试剂，进行扩增，扩增后加入磁珠纯化，即得纯化文库；

(5)文库质控：将步骤4得到的纯化文库进行质控，选择Qubit 3.0进行定量检测，Agilent2100或Agilent 4200进行定性检测，查看文库片段分布是否符合要求。

3.如权利要求2所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280＝1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg。

4.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的末端补平加A的反应是指DNA随机片段化至180-220bp，通过5'→3'聚合酶及3'→5'外切酶作用，进行末端补平,同时5'端进行磷酸化，其次3'加A，以便和测序接头进行连接。

5.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述连接illumina测序平台专用测序接头反应包括连接接头反应、消化反应及纯化反应，所述的连接接头是指在DNA片段两端连接illumina平台专用的测序接头，含有和平台芯片结合的特定序列P5、P7以及测序引物序列，其中P7端含有样本标签，长度6bp，其测序模板具体结构如下：

P5+Read1测序引物+插入DNA+Read2测序引物+Index(6bp)+P7。

6.如权利要求5所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述测序模板

序列一端为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

另一端序列为：

ATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC*NNNNNN*ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG,其中NNNNNN代表6bp碱基样本标签。

7.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)将步骤2得到的DNA文库进行文库混样，总量≥1-1.5μg，将不同样本标签的文库等量混合，加入样本标签对应的封闭引物试剂封闭DNA，浓缩烘干至干粉，再加入杂交缓冲液，混匀孵育，然后加入定制探针反应，反应结束后，加入预先处理的特定磁珠纯化，富集捕获到的目的区域DNA片段。