[发明专利]一种EP153R与EP402R基因共表达重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法

说明书

本发明提供了一种EP153R与EP402R基因共表达重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法，属于基因工程技术领域。一种EP153R基因与EP402R基因过表达腺病毒载体pAD‑Shuttle‑CMV‑CTLA4‑EP153R‑EP402R，以pShuttle‑CMV真核表达载体为基础，在多克隆位点处引入CTLA4、EP153R、EP402R基因。本发明还提供了共表达EP153R、EP402R基因的重组腺病毒，利用构建得到的pAD‑Shuttle‑CMV‑CTLA4‑EP153R‑EP402R载体实现腺病毒包装过程，得到能够直接感染动物或真核细胞的腺病毒，从而实现了EP153R与EP402R基因在真核细胞中共表达的目的，为研究实现EP153R与EP402R基因共表达的腺病毒疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉一种非洲猪瘟病毒EP153R与EP402R基因共表达重组腺病毒载体、构建方法及腺病毒包装方法。

背景技术

非洲猪瘟(african swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病。其特征为病程短、病死率高、临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。ASFV是一种直径为200nm的正二十面体病毒，病毒含有直径70～100nm DNA核心，外周是直径172～191nm二十面体的衣壳和含类脂的囊膜。ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，大小170～190kb(随毒株的不同而有差异)，末端交互连接，有末端倒置重复序列。基因组可以编码150～200种蛋白质，编码这些蛋白质的许多基因已被克隆和表达。

CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4)基因(NC_010457.5)即细胞毒性T细胞相关抗原-4：属于免疫球蛋白超家族,主要在活化的CD4+和CD8+T细胞以及激活的B细胞表面表达。CTLA-4可与CD28分子竞争结合T细胞上的B7分子,且其亲合力是CD28的10～50倍,因此是免疫应答负调节的主要表面吸附分子，可作为抗原递呈细胞的靶向分子，诱导强烈的体液和细胞免疫。

EP153R基因(NC_001659.2)全长474bp，编码产生158个碱基组成的跨膜蛋白，与CD44分子的N端区域有显著的同源性，包含N-糖基化位点、磷酸化作用位点、酰化作用位点、中央跨膜区、c型动物凝集结构域、细胞附着序列。EP153R基因主要在病毒感染的早期与晚期，据报道，EP153R基因可诱导或保持病毒CD2同源物与其相应受体的结合；EP153R基因的C型动物凝集结构域对MHC-I类抗原表达具有抑制作用；EP153R基因的存在使病毒感染或星形孢菌素处理Vero细胞中P53蛋白的转录活性降低，这是第一个描述具有抗凋亡特性的c型动物凝集素。构建表达EP153R基因的重组腺病毒载体能够更好的研究基因功能，为研发非洲猪瘟候选疫苗提供技术支持。

EP402R基因(NC_001659.2)编码CD2v，该蛋白具有信号肽序列和一个跨膜区，胞外区含有两个免疫球蛋白样结构域，其氨基酸序列与宿主细胞的CD2非常相似，但胞内区的氨基酸序列与CD2没有相似性，所以简称为CD2v。CD2是T细胞和NK细胞、B细胞和巨噬细胞的表面分子。其配体是表达在多种类型细胞表面的CD58分子，两者的结合对T细胞与抗原提呈细胞之间的结合具有稳定作用，因此参与T细胞的激活。CD2v能与宿主细胞的接合蛋白结合，干扰宿主细胞的胞吞和蛋白转运，导致被感染的巨噬细胞，其蛋白的分泌和分布发生改变，进而扰乱信号的传递，抑制淋巴细胞的功能。由于红细胞表面具有CD2的配体，所以ASFV感染细胞能借助其表面的CD2v分子与猪血液中的红细胞结合，形成特征性的花环，出现所谓的血吸附现象。CD2v还存在于病毒颖粒的外层，所以病毒颗粒也能吸附猪的红细胞，事实上在血吸附性病毒株感染猪的血液内，90％的病毒呈红细胞吸附状态，这种血吸附现象可能是病毒在猪体内扩散传播的重要机制之一。

而目前，现有技术中没有EP153R与EP402R基因共表达的重组腺病毒载体。

发明内容