[发明专利]一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法有效

专利信息
申请号: 201811497781.4 申请日: 2018-12-07
公开(公告)号: CN109486871B 公开(公告)日: 2021-10-26
发明(设计)人: 高超;马翠卿;严金鑫;刘秋媛;张一鹏 申请(专利权)人: 山东大学深圳研究院;山东大学
主分类号: C12P7/26 分类号: C12P7/26;C12N1/21;C12R1/10
代理公司: 济南圣达知识产权代理有限公司 37221 代理人: 李健康
地址: 518057 广东省深圳市南山区高新*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 利用 地衣 芽孢 杆菌 工程 菌株 发酵 生产 乙偶姻 方法
【说明书】:

本发明公开了一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法,是以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10‑1‑A为出发菌敲除其甘油脱氢酶gdh基因和2,3‑丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株,然后以葡萄糖为底物,生物发酵该菌,由发酵液得到乙偶姻。实验证实本发明的工程菌可生产82.14克/升的乙偶姻,生产效率达到2.28克/升/小时,且该生产过程成本低,产量高,具有很好的应用价值和可观的经济效益。

技术领域

本发明涉及一种发酵生产乙偶姻的方法,尤其涉及一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法。

背景技术

乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)是一种挥发性的化合物,它广泛应用于食品添加、植物生长促进及生物害虫防治等。另外,乙偶姻还可以作为一系列化合物的化学合成前体物质,如双乙酰及含烷基吡嗪,其中后者包括2,3,5,6-四甲基吡嗪。鉴于乙偶姻广泛的用途及实现工业化生产的潜力,其被美国能源部列为30种优先发展的平台化合物之一。

目前商业用乙偶姻主要来源是基于不可再生资源的化学合成方式,该工艺步骤复杂、反应条件苛刻、污染严重,且化学合成的乙偶姻在食品、医药、日化等领域的应用受到限制。也有众多研究者致力于利用微生物发酵实现乙偶姻的工业化生产,但相较于化学工艺方法,微生物发酵生产乙偶姻的成本依然较高。因此,降低乙偶姻产业对不可再生的石油资源的依赖,实现乙偶姻的绿色生产,提高微生物乙偶姻发酵工艺的经济竞争力,具有重要的经济效益和社会作用的意义。

检索发现:已有多种微生物被报道可用于乙偶姻发酵生产,美国专利(US0815840)报道了通过高耐糖筛选及NTG诱变,获得了一株短小芽孢杆菌,乙偶姻产量达到63g/L。孙建安等人通过在粘质沙雷氏菌中外源表达NADH氧化酶提高胞内NAD+浓度,以葡萄糖为碳源,最终乙偶姻产量达到75.2g/L,这是目前报道中乙偶姻产量的最高值。然而,利用敲除副产物2,3-丁二醇合成途径的关键酶基因(gdh和budC),并利用来自Thermococcusprofundus DT5432菌株中的NADH氧化酶基因(nox)替换地衣芽孢杆菌乳酸脱氢酶基因(ldh)降低副产物乳酸的产量方式构建地衣芽孢杆菌工程菌株,以实现乙偶姻的高效生产的方法还未见报道。

发明内容

针对该现有技术的不足,本发明的目的是提供一种利用构建的地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法。

本发明所述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法,步骤是:

(1)以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A为出发菌,敲除地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株,该工程菌株命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox;

其中,所述出发菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A已于2011年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCCNO.5461;

(2)以葡萄糖为底物,生物发酵地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox,由发酵液得到乙偶姻;

其中,所述发酵条件是:培养温度为50±1℃,培养方式为搅拌培养,搅拌转速为500±50转/分钟,旋转半径为33±1毫米,通气量为1.0±0.1vvm,培养时间为18~36小时;

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