[发明专利]一种基于Lamp技术的莲藕腐败病病原菌的检测方法及其应用

说明书

本发明基于Lamp技术对尖孢镰刀菌莲专化型病原菌进行快速检测，属于生物技术研究领域。通过对基因组的比较分析，获得了一个尖孢镰刀菌特有的基因组位点，在该位点上设计了一套引物(共六条)，结合成熟的Lamp检测反应液系统，可以从土样、发病组织以及培养物当中快速准确的鉴定尖孢镰刀菌。

技术领域

本发明采用基于Lamp技术的莲藕腐败病病原菌的检测方法，属于生物技术研究领域。

技术背景

莲藕腐败病又称为莲藕瘟病，是莲藕种植过程中的重要病害之一，藕田发病后通常减产20％，严重的可达60％～80％。本病由真菌尖刀镰孢菌莲专化型侵染引起【Fusariumoxysporum Schl.f.sp.Nelumbicola(Nis.&Wat.)Booth】，病菌以菌丝体及厚垣孢子随病残体在藕田土壤中越冬。病菌在条件合适的时候，从地下茎或根系的伤口侵入，然后在茎内蔓延，使其茎节及根系变色腐烂，并导致地上部叶片、叶柄以及莲蓬枯死。藕田水层浅，且常年连续种植莲藕的田块发病较重；土壤酸性大、通气性差的田块发病重。该病5～6月份到收藕期均有可能发生，7～8月份为盛发期。病害发生早中期叶片整体呈现西瓜皮状，叶片主脉区域质地正常，但主脉间以及叶缘部位呈现烫伤状青枯、变脆，其原因是高温晴天条件下水分不能正常疏导所致；中后期叶片叶缘上表面变灰色，干枯、卷曲；叶主脉部位保持绿色，但主脉间与叶缘症状相似。枯萎症状由叶缘至叶脐逐步发展。此外，叶柄基部横切可见棕褐色病变。

莲藕腐败病菌属于土传病原真菌，在侵染初期常没有明显症状。一旦莲藕植株表现出发病症状，再对其进行药剂治疗则为时已晚。因此，对该病的预防以及对其病原菌的早期检测就变得非常重要。

Lamp(环介导等温扩增，Loop-mediated isothermal amplification)技术于2000年发表在著名生物学杂志《Nucleic Acids Research》上，因为该技术对靶标核酸序列具有高特异性、高敏感性、操作简便等特点，很快就被广泛应用到分子生物学检测领域。目前，在人类临床疾病的诊断、动植物病原微生物的定性定量检测等领域，Lamp技术都是一个重要的辅助手段。该技术的原理可以简要的概括如下：至少4种特异引物，分别为FIP(上游内部引物)，BIP(下游内部引物)，F3(上游外部引物)和B3(下游外部引物)，同时依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，在65℃的含有必须的离子和底物的反应液中，靶标DNA链形成单链置换DNA，然后在FIP和BIP的位置形成颈环结构。利用颈环结构以及链置换DNA聚合酶，链置换型DNA合成在不停地自我循环，并逐步延长和放大。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生焦磷酸镁沉淀逐步积累，呈现浑浊，最后，通过肉眼或者浊度仪，即可以判断在检测样品当中是否有靶标DNA片段。

发明内容

本发明根据已经公布的14种尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的基因组信息，以及6种与尖孢镰刀菌亲缘关系较近的其它镰刀菌属(Fusarium spp.)的标准菌株的基因组信息，通过基因组的相互比较，找到了24个在尖孢镰刀菌当中存在，但在其它物种当中不存在的特异核酸位点。进一步对这24个位点进行分析后，我们选择了1个编码推测蛋白的核酸序列，其对应的基因编号为FOXG_10191。针对该位点，我们设计一套共6条用于Lamp技术检测的引物。经过尝试，该套引物可以在实验室内快速鉴定莲藕腐败病病原菌。

相关技术路线如下：

1.尖孢镰刀菌的基因组序列比对分析，以及特异性位点的筛选。

2.对在尖孢镰刀菌中找到的特异性位点进行alignment分析，并选择出一段大概300bp左右的保守序列。